生活史性狀和取樣策略對植物微衛星遺傳多樣性參數估算的影響

杜夏瑾，黎嘯峰，吳 敏，王 麗

(中南大學生命科學學院，中國長沙 410013)

遺傳變異是物種長期存在和進化的物質基礎.因此，遺傳多樣性的度量和描述是種群和進化遺傳學研究、生物多樣性保護和管理中的中心問題.Hamrick，Godt，Nybom，Bartish，Nybom 和Duminil 等［1－4］的研究表明，植物遺傳多樣性水平及其遺傳結構與物種本身的繁育系統、種子傳播方式和分布范圍等生活史性狀關系密切.合理的取樣策略在遺傳多樣性研究、生物多樣性保護和利用中具有重要的意義.取樣理論近幾十年來被廣泛研究［5－8］，隨著更多的遺傳標記的出現，該理論需要不斷更新，因為不同的遺傳標記和方法所得出的結果有差異，如何在物種保護中合理取樣和有效地分析遺傳數據也有待完善.

微衛星(microsatellites)亦稱簡單重復序列(simples sequence repeats，SSRs)，由于其共顯性、重復性好及高變異性等優點，已在植物群體遺傳學研究、品種鑒定、連鎖圖譜構建、系統發育和分子標記輔助育種等方面得到了廣泛的應用.近二十年來，大量群體遺傳學研究借助于微衛星分子標記技術展開，但其種群遺傳變異的分析主要是估測一系列有代表性的參數，如觀測雜合度(Observed heterozygosity，HO)，期望雜合度(Expected heterozygosity，HE)，NA(Observed number of alleles，觀測等位基因數)，NE(Effective number of alleles，有效等位基因數)，FIS(Breeding coefficient，近交系數)和FST(Genetic differentiation index，遺傳分化指數)等.

為了探討植物生活史性狀和取樣策略對微衛星遺傳參數估算的影響，本文對139 篇1999—2012年所報道的150 種野生種子植物基于微衛星分子標記的遺傳多樣性參數進行了統計分析，以期為種子植物遺傳多樣性的相關研究提供有價值的參考.

1 材料與方法

通過Web of science 和Google scholar 檢索關于種子植物遺傳多樣性的文獻，整理近十年發表在國外知名期刊上有關SSR 標記的野生種群遺傳多樣性的研究，得到各項取樣策略參數和遺傳多樣性參數，主要有取樣種群數、取樣個體數、最大取樣距離、SSR 標記數、觀測雜合度(HO)、期望雜合度(HE)、觀測等位基因數(NA)和遺傳分化系數(FST與RST).由于檢測方法(銀染和測序)對多態性高低有直接的影響，因此檢測方法也作為一種因素用于分析.

數據整理原則:(1)限于種子植物，即裸子植物、雙子葉植物和單子葉植物，不統計蕨類、藻類及真菌等;(2)限于野生植物種群，不統計栽培品種;(3)限于研究的野生種群數大于或等于2 的文獻.另外，如果一篇文獻中對兩種或兩種以上的植物進行了研究，分析不同的植物時作為獨立的文獻進行統計.

本文將植物生活史特性分為5 個方面:分類地位、繁育系統、生活型、分布范圍和種子傳播.分類地位包括裸子植物、雙子葉植物和單子葉植物.繁育系統包括自交、混交和異交.生活型包括一年生植物、短壽多年生植物(多年生草本植物)和長壽多年生植物(多年生喬灌木和藤本植物).分布范圍包括特有種、窄域種、地方種和廣布種.種子傳播包括重力傳播、附著傳播、吞食傳播和風/水傳播.

利用SPSS 19.0(IBM Company，2010)計算各項參數的平均值和標準差，對各取樣策略參數之間、遺傳多樣性參數之間以及取樣策略與遺傳多樣性參數之間進行了Pearson 相關分析，為了進一步探討取樣策略參數和遺傳參數之間的關系以及不同生活史性狀內(主要是繁育系統和分類地位)二者之間的關系，作者以4 個取樣策略參數作為自變量，4 個遺傳多樣性參數作為因變量進行了回歸分析.為了進行不同生活史類型植物間遺傳參數的比較，還將不同生活史變量與4 種遺傳參數分別進行了單因素方差分析(One－way ANOVA).

2 結果

作者收集了330 篇關于種子植物遺傳多樣性的文獻，統計得到341 種植物的遺傳多樣性參數值，剔除數據不全的文獻和物種，最終用于分析的物種有150 種.其中裸子植物24 種，雙子葉植物95 種，單子葉植物31種;遺傳多樣性參數個數不少于3 個的有110 種.

2.1 參數統計

150 種植物的平均取樣種群數為11(變化范圍2～42，SD=7.77)，每個種群的平均取樣個體數為31(變化范圍4～144，SD=23.58)，取樣種群間的平均最大取樣距離為716.06 km(變化范圍0.01～3 333.33，SD=830.27)，SSR 標記數為9.37(變化范圍2～25，SD=4.86)(表1).Pearson 相關性分析表明，平均取樣種群數與每個種群的平均取樣個體數之間有極顯著的負相關性(r=－0.250，df=149，P ＜0.01)，與平均最大取樣距離之間具有極顯著的正相關性(r=0.296，df=149，P ＜0.001)，與標記數之間有一定的負相關關系，但相關性不顯著(r=－0.153，df=149，P=0.062);每個種群的平均取樣個體數與平均最大取樣距離之間具有顯著的負相關性(r=－0.174，df=149，P ＜0.05)，與標記數之間也有一定的負相關關系，相關性不顯著(r=－0.156，df=149，P=0.057);平均最大取樣距離與標記數無相關性(r=0.043，df=149，P=0.598).

統計所有的150 種植物，得到105 個FST，平均值為0.220，標準差為0.200;37 個RST，平均值為0.227，標準差為0.205(表1).統計28 種同時采用了FST和RST這兩種種群分化指數的植物，成對樣本的t 檢驗(Paired－Samples T Test)結果表明二者之間沒有顯著性差異(平均值分別為FST=0.238，RST=0.256，P ＞0.05，t=－2.096，df=27).統計得到114 個HO，平均值為0.450，標準差為0.212;得到119 個HE，平均值為0.545，標準差為0.197;得到93 個NA，平均值為6.099，標準差為3.916.統計106 種同時采用了HO和HE這兩種指數的植物，經成對樣本t 檢驗，二者之間差異極顯著(平均值分別為HO=0.456，HE=0.546，P ＜0.001，t=－7.238，df=105).而且，在統計的所有植物中，有91 種植物遺傳多樣性分析得到的HE＞HO，僅有15 種植物遺傳多樣性分析得到的HE＜HO.Pearson 相關性分析表明，種群分化指數FST與多樣性指數HO(r=－0.748，df=77，P ＜0.001)和HE(r=－0.744，df=80，P ＜0.001)均呈極顯著負相關關系，種群分化指數RST與多樣性指數HO(r=－0.735，df=30，P ＜0.001)和HE(r=－0.703，df=26，P ＜0.001)也均呈極顯著負相關關系.

2.2 取樣策略對遺傳參數的影響

把4 個取樣策略參數作為自變量，4 個遺傳多樣性參數作為因變量進行回歸分析(表2)，結果表明，取樣種群數和取樣個體數對各遺傳參數沒有影響，種群間多樣性指數FST隨著SSR 標記數的增加而增加，多樣性指數HO和HE隨著SSR 標記數增加而減少，多樣性指數HO也會隨著取樣距離的加大而增加，Pearson 相關分析表明取樣距離與種群間多樣性指數FST和RST均呈正相關(圖1).

圖1 種群間多樣性指數與取樣距離的相關關系示意圖Fig.1 The relationship between on the one hand logarithmic values for maximum distance between collected populations，and on the other hand between－population diversity estimates，FST(filled symbols)and RST(open symbols)

2.3 檢測方法對遺傳參數的影響

統計的150 種植物中有58 種植物采用電泳銀染技術進行結果檢測，有89 種采用測序技術，有3種使用瓊脂糖EB 檢測方法，由于瓊脂糖檢測技術用得非常少，在此僅針對前兩種方法展開分析.使用測序檢測方法得出的HO，HE和NA(平均值分別為0.486，0.570，6.68;標準差分別為0.211，0.199，3.985)均高于電泳銀染技術得出的HO，HE和NA(平均值分別為0.431，0.529，5.43;標準差分別為0.185，0.182，3.734)，而使用測序檢測方法得出的FST和RST(平均值分別為0.201，0.200;標準差分別為0.200，0.163)卻低于電泳銀染技術得出的FST和RST(平均值分別為0.233，0.221;標準差分別為0.175，0.193).

2.4 不同生活史類型植物間的遺傳參數比較

上文(2.2)提到遺傳參數HO，HE和FST會隨著SSR 標記數的變化而變化，為了進一步探討各遺傳參數在不同繁育系統類型和不同分類地位植物中是否會受SSR 標記數的影響，作者分別進行了種群間多樣性指數HO，HE和FST與SSR 標記數的回歸分析，結果表明，在不同繁育系統類型植物中除在異交類群中HO會隨著SSR 標記數的增加有一定增加外，其他類群各參數都不會受SSR 標記數的影響，雙子葉植物的遺傳參數受SSR 標記數影響較大，裸子植物和單子葉植物受SSR 標記數影響較小(表2).

表2 取樣策略參數與遺傳參數回歸分析結果Tab.2 Regression analysis with four sampling strategy parameters and genetic parameters

本文所統計的150 種植物，按不同的生活史類型劃分得到的遺傳參數數目差異較大，例如，附著傳播的植物得到的遺傳參數數目為0，長壽多年生的植物得到的遺傳參數數目遠遠多于一年生或者短壽多年生的植物(表3).對不同生活史變量與4 種遺傳參數分別進行單因素方差分析(One－way ANOVA)，結果表明，對于不同的繁育系統和生活型的植物，多樣性指數HO和HE差異極為顯著(P ＜0.001)，種群間多樣性指數FST差異也極為顯著(P ＜0.001)，RST在不同生活型的植物間差異也極為顯著(P ＜0.001)，但在不同繁育系統的植物間差異顯著(P ＜0.01).組間兩兩比較(Post Hoc Multiple Comparisons)結果表明，自交植物的HO和HE(平均值分別為HO=0.120，HE=0.303)均明顯低于混交(平均值分別為HO=0.410，HE=0.575)或異交(平均值分別為HO=0.503，HE=0.563)植物，但自交植物的遺傳分化系數FST和RST(平均值分別為FST=0.520，RST=0.555)均明顯高于混交(平均值分別為FST=0.233，RST=0.155)或異交(平均值分別為FST=0.181，RST=0.183)植物.一年生植物(平均值分別為HO=0.012，HE=0.203)的多樣性指數HO和HE均明顯低于短壽多年生(平均值分別為HO=0.369，HE=0.513)或長壽多年生(平均值分別為HO=0.490，HE=0.580)植物，遺傳分化系數FST的平均值為0.590，明顯高于多年生植物，由于統計得到的RST數目較少，甚至缺少一年生植物的RST值，因此不予比較.

表3 不同生活史組變量與遺傳參數的方差分析Tab.3 Analysis of variance conducted with different life history traits as group variable，and with mean genetic parameters HE，NA，FST and RST as dependent variables

單因素方差分析(One－way ANOVA)上述4 個遺傳參數結果表明，不同種子傳播類型或分布范圍的植物均沒有顯著性差異(P ＞0.05).但可看出靠重力傳播的物種HO和HE高于其他3 種類型的植物;地方種的HO和HE略低于其他3 種類型的植物，廣布種的HO和HE最高，說明廣布種具有高水平的種群間多樣性.

對于不同分類地位的植物，多樣性指數HO和HE差異較顯著(P ＜0.05)，遺傳分化系數RST差異較顯著(P ＜0.05)，但遺傳分化系數FST之間沒有顯著性差異(P ＞0.05).裸子植物(平均值分別為HO=0.492，HE=0.596)和雙子葉植物(平均值分別為HO=0.473，HE=0.561)的多樣性指數HO和HE均明顯地高于單子葉植物(平均值分別為HO=0.350，HE=0.448)，從本研究的統計結果看，裸子植物在種群水平上具有比被子植物更高的遺傳多樣性，但裸子植物和雙子葉植物的遺傳分化系數RST則低于單子葉植物.

3 討論

3.1 取樣策略

SSR 標記在遺傳多樣性和遺傳分化研究中是一個非常重要的工具，而在SSR 相關研究中取樣策略的制定對SSR 研究結果解釋的可靠性至關重要［2－3，5］.本次研究統計得到的平均取樣種群數為11，種群的平均取樣個體數為31.本次研究發現統計的150 種植物中，平均取樣種群數小于4 的植物僅有16 種，每個種群平均取樣個體數小于10 的植物僅有5 種，平均取樣個體數大于50 的植物有17 種.取樣種群數和取樣個體數對本研究選取的4 個遺傳多樣性參數均沒有影響，而SSR 標記數與遺傳分化系數FST呈顯著正相關，與多樣性指數HO和HE呈顯著負相關，這可能是由于單個標記的多態性較低時，研究者們都傾向于探討更多的標記從而增加結果的可靠性.

Nybom 和Bartish［2］的研究表明，取樣種群數、取樣個體數和RAPD 標記數對各遺傳參數(ΦST，GST，Hpop)沒有明顯影響，但是ΦST、GST值會隨著種群間的取樣距離的增加而增加，Hpop隨著取樣距離的增加而減小，進一步的分析發現只在異交植物類群中ΦST、GST值會隨著種群間取樣距離的增加而增加，自交植物類群中ΦST，GST與取樣距離之間無顯著相關關系.作者的統計結果表明，遺傳參數HO會隨著取樣距離的增加減少，HE，FST和RST與取樣距離之間相關關系雖然不顯著，但FST和RST值也是隨取樣距離的增加而增加的.兩種標記得出的結論基本一致.

3.2 遺傳參數的估測

本次統計的106 種同時采用了HO和HE這兩種多樣性指數的植物中，有91 種植物HE＞HO，僅有15 種植物HE＜HO.這可能是SSR 標記中短鏈等位基因優勢或者無效等位基因的出現造成的［9－10］.在研究群體遺傳結構時，無限等位基因模型(Infinite Allele Model，IAM)［11－12］是廣泛采用的模型，基于這一模型的種群間遺傳分化指數一般以FST來表示，它通過等位基因頻率計算得到，但它需要種群處于Hardy－Weinberg 平衡時才有意義［13－14］.RST則是基于逐步突變模型(Stepwise Mutation Model，SMM)［15］得到的遺傳分化指數，因為大多數微衛星座位的突變都是由一小部分重復單元的增加或減少引起的，所以在SSR 遺傳多樣性分析中SMM模型更貼切［16］.一般認為，遺傳較近或者地理距離較近的種群遺傳分析比較適合選用FST指數;而考慮到距離隔離的影響，距離較遠一些的種群遺傳分析更適合RST指數［17－19］.此外，選擇FST或者RST指數，還需要考慮一些取樣策略因素，例如取樣種群大小、取樣個體數目和SSR 標記數目等［20］.一些研究表明，對于SSR 標記而言，基于IAM 模型得到的遺傳分化值FST經常低于基于SMM 模型得到的遺傳分化值RST［16，19］.本文中，對28 種同時采用了FST和RST這兩種種群遺傳分化指數的植物進行統計分析，結果表明二者之間沒有顯著性差異，但FST平均值略低于RST平均值.

3.3 不同生活史類型植物間的遺傳多樣性指數比較

本次研究發現，繁育系統、生活型和分類地位與種群遺傳參數具有較大關聯，而種子傳播類型和分布范圍對各遺傳參數影響不顯著.

Hamrick，Godt［1］和Ellstrand，Elam［21］認為植物的繁育系統可作為解釋遺傳多樣性水平的主要因素，在自交種群和其他類型種群之間差異顯著.本研究發現，自交植物在種群水平上的遺傳多樣性水平明顯低于其他類型植物，而遺傳分化程度則相對較高，這與已有的研究結論一致［1－3，22］.

作者還發現，不同生活型的植物各遺傳多樣性指數差異極為顯著.一年生植物的多樣性指數HO和HE值均明顯低于短壽多年生或長壽多年生植物，且長壽多年生植物HO和HE的平均值最大;長壽多年生植物的遺傳分化系數FST和RST均較低.而在Hamrick，Godt［1］，Nybom，Bartish［2］及Nybom［3］的統計中，長壽多年生植物的H 參數也都比較高，而遺傳分化值比較低.

從本研究的統計結果看，分類地位與種群多樣性具有一定關聯.總體上，裸子植物的遺傳多樣性水平高于被子植物，但裸子植物和雙子葉植物的HO和HE值差異不明顯，均明顯地高于單子葉植物.裸子植物種群間遺傳分化值(FST和RST)均相對較低，這與Nybom，Bartish［2］和Hamrick，Godt［1］的統計結果一致.因此，裸子植物和雙子葉植物較高的種群內遺傳多樣性可能與其長壽多年生和異交繁殖等生活史特征有關［2，23］.

Hamrick，Godt［1］和Karron［24］的研究結果都表明，特有或瀕危種的遺傳變異水平比廣布種低，特別是在種群水平上.但是，也有研究認為，地理分布范圍并不是決定物種的遺傳多樣性水平和遺傳結構的重要因素.近年來有不少研究表明，一些特有和瀕危物種卻保持著較高水平的遺傳變異，如太白紅杉Larix potaninii var.chinensis，尾葉桉Eucalyptus urophylla 和短葉雪松Cedrus brevifolia 等［25－27］.本文中，分布范圍對多樣性指數影響不顯著，這與Nybom，Bartish［2］基于RAPD 標記的統計結果基本一致，而與Hamrick 和Godt［1］基于等位酶與Nybom［3］基于STMS 標記的統計結果不同，Nybom［3］的結果表明不同分布范圍HO和HE差異較顯著(P ＜0.05)，而FST的差異不顯著，鑒于張德全［22］的研究，HO和HE不適合在不同標記之間進行比較，但遺傳分化參數在不同標記中的研究結果基本一致，即無論是RAPD 還是SSR，不同分布范圍對FST的值影響不是很大.即使如此，本文與已有的研究都表明，廣布種一般都表現出較高的遺傳多樣性.因此，作者認為，廣布種在通常情況下具有較特有或瀕危種更高的遺傳多樣性，但這不是絕對的;一些人為因素導致的瀕危種，如黃山梅Kirengeshoma palmata，由于其遺傳基礎較豐富，其野生種群數量和個體數量可能很少，仍然可能維持著較高的遺傳多樣性［28］.

本研究還發現，不同種子傳播類型的植物統計得到的遺傳參數之間均沒有顯著性差異，這與Nybom［3］的統計結果不一致，卻與Nybom 和Bartish［2］的統計結果一致.但Nybom 和Bartish［2］在附著傳播和風/水傳播的統計植物均只有3 種，其統計的隨機誤差可能較大.

綜上所述，鑒于自交植物、一年生植物和單子葉植物的遺傳多樣性指數水平較低，考慮到SSR 標記數與各遺傳參數有顯著的負相關關系，因此建議在進行自交植物、一年生植物和單子葉植物的相關研究時可選用較少的SSR 標記，而在異交植物、多年生植物、裸子植物和雙子葉植物的相關研究中可選用較多的SSR 標記.

4 結論

本文探討了基于SSR 標記的取樣策略和植物生活史特性對遺傳多樣性參數的影響.統計結果表明，SSR標記數目與各種群遺傳參數顯著相關，研究者增加標記的使用數目，可以有效提高種群遺傳分析中的遺傳分化值;而取樣距離對種群間遺傳多樣性指數的正相關影響，已經得到許多相關研究的證明.對不同生活史特性植物遺傳多樣性的統計分析表明，繁育系統、生活型和分類地位與種群遺傳多樣性指數具有較大關聯，自交植物的遺傳多樣性水平明顯低于其他類型植物;一年生植物的遺傳多樣性水平明顯低于短壽多年生或長壽多年生植物，且長壽多年生植物的遺傳多樣性水平最高.傳播類型和分布范圍對各遺傳指數影響不顯著.考慮到SSR 標記數與遺傳參數(HO，HE)有顯著的負相關關系，因此建議在進行異交植物、多年生植物、裸子植物和雙子葉植物的相關研究中可選用較多的SSR 標記.此外，檢測方法對遺傳參數也有一定的影響，使用測序技術得出的遺傳參數HO，HE和NA均高于電泳銀染技術.

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