攜帶抗稈銹病基因Sr25、Sr26小麥新種質的分子標記輔助選育

崔彩紅+房偉強+李興鋒+王洪剛+鮑印廣

摘 要：源于長穗偃麥草的抗病基因Sr25、Sr26對稈銹病強毒力小種Ug99及其變種具有良好抗性，本實驗室前期在長穗偃麥草與普通小麥雜交后代中選育出兩個攜帶Sr25、Sr26基因的八倍體小偃麥。本研究選用濟麥22、泰農18、山農637等小麥品種（系）分別與兩個八倍體小偃麥雜交、同交，利用與Sr25、Sr26緊密連鎖的分子標記進行輔助選擇，定向培育出9個含有Sr25或（和）Sr26的小麥新種質。這些新種質綜合農藝性狀優良，可以作為抗病新種質用于小麥抗病育種，以應對Ug99威脅。

關鍵詞：小麥；稈銹?。籗r25；Sr26；分子標記輔助選擇

中圖分類號：S512.103.4 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2015）04-0013-05

小麥稈銹病是由禾柄銹菌小麥?；停≒uccinia graminis f. sp. tritici）引起的一類真菌性病害，可導致小麥減產75%，甚至絕產。自20世紀70年代開始，各國小麥育種工作者與病理學家共同努力，不斷發掘新的抗性基因，特別是源于黑麥1R染色體的Sr31基因的廣泛應用，使稈銹病得到了有效控制[2]。然而，1999年烏干達發現了致病力極強的新型稈銹病小種Ug99，它不但克服了Sr31的抗性，而且其變異菌株使得Sr24、Sr28、Sr29、Sr33、Sr36、Sr38等基因也喪失了抗性[3～7]。2006年，在肯尼亞鑒定的我國118份主栽小麥品種中，只有山東省農業科學院育成的濟麥20表現高抗，這說明Ug99一旦傳入中國，由于現有品種抗性普遍較差，很有可能對我國小麥生產帶來災難性危害[8，9]。

收稿日期：2015-03-10

基金項目：山東省高等學校科技計劃項目（J11LC25）；山東省農業良種工程項目“農業生物資源創新利用研究”

研究表明，源于長穗偃麥草（Thinopyrum ponticum）的抗稈銹病基因Sr25、Sr26對Ug99及其變異菌株具有良好抗性[10]。目前，已有學者開發了與Sr25[10，11]、Sr26[10，12]緊密連鎖的分子標記，為進行分子標記輔助育種提供了便利。本實驗室在普通小麥與長穗偃麥草的雜交后代中，選育出兩個八倍體小偃麥SN19和SN20，經分子標記檢測，SN19含有Sr26，SN20同時含有Sr25和Sr26。本研究利用不同小麥品種（系）分別與SN19、SN20進行雜交、回交，并利用與Sr25、Sr26緊密連鎖的分子標記對其后代進行輔助選擇，定向培育攜帶Sr25、Sr26基因的小麥新種質，為應對Ug99入侵提供種質儲備。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究所用材料包括小麥品種濟麥22、泰農18、山農優麥3號、煙農15，本實驗室選育的兩個八倍體小偃麥SN19、SN20和高代品系山農126、山農637。以上材料均由國家小麥改良中心泰安分中心提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 種質系的創制與選育 分別以八倍體小偃麥SN19、SN20為母本，以普通小麥品種（系）為父本進行雜交、回交，在BC1F1世代利用分子標記輔助選擇含有Sr25、Sr26的單株；以普通小麥為輪回親本與當選單株再進行回交、自交，利用分子標記對每個世代進行輔助選擇，結合溫室加代，以獲得含有Sr25、Sr26且性狀基本穩定的種質系。

1.2.2 性狀調查 參照李立會和李秀全[3]的方法。

1.2.3 DNA提取 采集新鮮小麥葉片，按CTAB法[4]提取DNA。

1.2.4 引物選擇 根據已發表的與抗稈銹病基因Sr25[11]、Sr26[10]緊密連鎖的分子標記，由上海生工生物技術公司合成（表1）。

1.2.5 PCR反應體系與程序 引物PSY-E1、Sr26#43+ BE518379的反應體系及擴增程序分別參照Zhang和Dubcovsky[11]、Liu等[10]的方法。

2 結果與分析

2.1 攜帶Sr25種質的選育

以普通小麥濟麥22、山農優麥3號、山農637、山農126為陰性對照，以八倍體小偃麥SN20為陽性對照，利用與Sr25緊密連鎖的標記PSY-E1對各世代進行選擇，不含Sr25的材料無擴增產物，含有Sr25的材料在191 bp處擴增出一條特異帶、如源于SN20/山農637組合的單株204-1、204-3、204-5、204-7、205-1、205-3、205-4、205-5、206-1（圖1），源于SN20/濟麥22組合的單株180-1、180-2、180-3、180-4、180-10、181-1（圖2）均可擴增出大小約191 bp的特異帶，說明這些單株含有Sr25，而其余單株則不含Sr25。

2.2 攜帶Sr26種質的選育

分別以八倍體小偃麥SN19、SN20為陽性對照，以普通小麥親本為陰性對照，利用引物組合BE518379+Sr26#43對雜種后代進行分子檢測。普通小麥只能在303 bp處由引物BE518379擴增出一條源于小麥6A染色體的特異帶，陽性對照和含有Sr26基因的后代單株可以在207 bp處擴增出一條由引物Sr26#43產生的Sr26特異帶。兩個標記結合應用，不但可以檢測Sr26基因的有無，還可以檢測普通小麥6A染色體是否發生變異。

由圖3、圖4可以看出，SN20與山農優麥3號雜交后代216-6、217-1、176-8、176-9、176-10單株，SN19與泰農18雜交后代258-2、258-3、258-4、258-6、258-10、259-1、259-3、259-4、259-6、259-7、259-8單株可同時擴增出207 bp和303 bp兩條特異帶，表明它們含有Sr26基因且6A染色體沒有發生變異；單株S258-7僅能擴增出207 bp的特異帶，表明其含有Sr26基因，且6A染色體在引物BE518379位點處發生了變異；其余單株儀能擴增出303 bp的特異帶，而沒有207 bp的特異帶，表明它們不含有Sr26，6A染色體也沒有發生變異。endprint

2.3 攜帶Sr25、Sr26種質的性狀特點

對部分形態學基本穩定的種質進行性狀調查，結果見表2?？梢钥闯?，176-8、184-2、193-1、198-10四個種質具有矮稈特點，株高介于64.8～69.2 cm之間；187-4、199-2、259-1、262-2株高中等；而186-2植株則較高，達111.5 cm。穗長方面，只有262-2為8.9 cm，其余皆超過9 cm，199-2和259-1則超過10 cm。就穗粒數而言，9個種質結實性較好，其中184-2、259-1超過50粒。上述種質不但含有Sr25和（或）Sr26基因，而且綜合農藝性狀較好，可以作為親本在育種中加以利用。

3 討論與結論

強毒力小種Ug99及其變異菌株可以侵染全球約90%種植面積的小麥品種，因此引起了世界各國包括諾貝爾獎獲得者布勞格博士的高度關注[8]。世界糧農組織為此專門組織成立了“全球小麥銹病協作網”（The Global Rust Initiative），并提出了通過培育多抗性品種持久控制小麥稈銹病的策略[15]，而利用抗病基因創制抗病種質是這一策略得以實施的基礎和前提。

Sr25源于長穗偃麥草，位于7E染色體長臂抗葉銹病基因Lr19末端，曾被轉移至小麥7D染色體上[16]，被CIMMYT廣泛應用于小麥育種中[17]。該基因與高黃色素基因PSY-E1緊密連鎖，因此PSy-E1的特異引物可以作為特異標記用于定向檢測Sr25。韓建東[18]、吳限鑫[19]等學者曾分別利用特異引物對我國150份小麥材料和云南省119份小麥品種（系）進行檢測，均未檢測到Sr25，說明該基因在我國較為缺乏。本研究利用特異標記PSY-E1，在八倍體小偃麥與濟麥22、山農126、山農637雜交后代中篩選出5個種質，它們不但含有Sr25基因，而且綜合農藝性狀優良，可以作為親本用于小麥育種，以改善我國缺乏Sr25基困的境況。

Sr26源于長穗偃麥草，位于6E染色體長臂，曾被轉移至小麥6AL上[16]。該基因可以抵抗Ug99及其變異菌株等許多優勢小種[10]，自20世紀80年代廣泛應用于澳大利亞小麥育種和生產以來，一直保持良好抗性，但在其他國家尚未得到應用[8，9]。在我國，曾有多位學者通過基因推導分析法推測我國部分小麥品種可能含有Sr26[20～23]。2005年，Mago等開發了Sr26的STS顯性標記Sr26#43，并用于分子標記輔助選擇[12]。之后，經Liu等[10]驗證，將小麥6A染色體特異標記BE518379與Sr26#43相結合，可以作為共顯性標記用于Sr26的分子診斷，李偉華[24]利用Sr26#43對我國北方448個小麥品種進行檢測，結果只有墾九10號和保豐104兩個品種含有Sr26本研究結合應用Sr26#43和BE518379兩個標記，在八倍體小偃麥與普通小麥品種（系）雜交后代中，選育出5個含有Sr26基因的種質，并且發現其6A染色體均沒有發生變異，推測其中的Sr26基因可能轉移到了小麥的其它染色體上。

本研究選用農藝性狀優良的小麥品種（系）與八倍體小偃麥雜交、回交，在分離后代中利用與抗稈銹病基因Sr25、Sr26緊密連鎖的分子標記進行輔助選擇，定向培育了4個含有Sr25、4個含有Sr26、1個同時含有Sr25和Sr26的小麥新種質這些新種質結實性好，綜合農藝性狀優良，可以作為育種親本用于小麥抗稈銹病育種，以應對Ug99威脅。endprint