1D TOCSY 技術用于水溶液中氨基葡萄糖結構指認

葉劍良， 歐陽捷， 陳 忠

(廈門大學a. 化學化工學院;b. 物理與機電工程學院，福建 廈門361005)

0 引 言

D-氨 基 葡 萄 糖 鹽 酸 鹽 (D-Glucosamine Hydrochloride，GAH，化學名為2-氨基2-脫氧D-葡萄糖鹽酸鹽)和 N-乙酰-D-氨基葡萄糖(N-Acetyl-DGlucosamine，GlcNAc)是生物體細胞中糖鏈的重要組成單元，也是一類具有顯著生物活性的氨基葡萄糖類化合物［1］。氨基葡萄糖在人體內分布非常廣泛，其在血液中的正常濃度比葡萄糖濃度還高。但一般都以與蛋白質結合的狀態參與人類的重要生理活動［2］，無游離態存在。由于具有顯著的抗炎、抗腫瘤、抗氧化、免疫調節和防腐抗菌等功效［3-5］，這類化合物在藥物、保健食品和美容產品中應用廣泛。開展氨基葡萄糖結構及光譜學特性的研究，能夠為該類化合物的化學修飾改性工作提供很好的參考價值［6-9］。

核磁共振(NMR)應用于糖化合物的結構鑒定［10］始于20 世紀70 年代，該技術可直接測定單糖、寡糖以及糖鏈的結構，能為研究者省去許多復雜的化學降解步驟。但目前有關氨基糖及其衍生物的NMR 譜研究報道相對較少［3，11］。而氨基糖類化合物在水溶液中很容易發生變旋，由單一構型化合物變為α，β 兩種構型的混合物，加之糖環質子化學位移差異不大，導致信號相互重疊交叉嚴重，極大增加了核磁譜圖的復雜性。如果遵循常規思路，需要各類型1H、13C 及2D NMR(包括COSY、HSQC、HMBC、TOCSY 甚至NOESY 等)實驗數據綜合推敲，才能保證此類化合物的結構得以準確解析。本文利用選擇性1D TOCSY 技術隨混合時間的延長能由近到遠順序提取耦合網絡中不同位置質子信息的特點［12-13］，使得同一端基異構體糖環上的質子選擇性地順序出峰，有效地消除了譜峰重疊的影響，快速、明確地完成了無法分離的α，β-氨基糖端基異構體混合物的質子信號的分組歸屬和核磁信息全指認流程。該結論得到了2D NMR 實驗數據的很好驗證。

1 實驗部分

1.1 儀器設備

實驗均在AVANCE Ⅲ500 型超導核磁共振波譜儀(德國布魯克公司)上完成，配有11.74 T 牛津超導磁體，三通道檢測系統，BVT3000 溫控單元，5 mm Z 梯度寬帶探頭(BBO Probe)和TOPSPIN2.1 核磁共振專用軟件。

1.2 試劑和樣品

重水(D2O，北京金鷗翔科貿有限公司，氘代度大于99.9%)。

待測樣383 和170 均為白色粉末狀晶體，易溶于溶劑重水(D2O)，分子式為C6H14NO5Cl 和C8H15NO6，初步判斷為化合物D-氨基葡萄糖鹽酸鹽和N-乙酰-D-氨基葡萄糖。

1.3 實 驗

1D TOCSY［14-15］技術是二維TOCSY 實驗的一維簡化，選擇性1D TOCSY［16］則是通過優化整形脈沖的脈沖形狀、寬度、強度、間隔(即混合時間)，對目標核進行激發，最終能夠選擇性地順序(隨相隔共價鍵數由近及遠)獲得同一自旋體系下，與激發核直接或間接耦合的質子信息［17］，在糖環類結構解析中具有獨特的優勢［18-19］。綜合選擇性、信噪比及峰型等方面的實驗效果考慮，本工作選擇Gaussian 脈沖，以糖環上異頭質子峰為激發中心，信號激發寬度為16 Hz。通過改變整形脈沖的混合時間，獲得系列1D TOCSY 譜，對糖環質子位移信息進行指認。混合時間選擇區間為10 ～200 ms。

在此基礎上，結合13C NMR、DEPT135、HSQC 和HMBC 實驗結果完成對2 種氨基糖類化合物的α，β構型混合物氫、碳核磁信息的全指認。所有實驗均在室溫條件(298 K)條件下完成。

2 結果與討論

2.1 常規1H NMR、13CNMR 數據分析

重水溶解待測樣383 和170，其常規1H NMR 譜的信號均明顯嚴重重疊(見圖1)。以樣品383 為例，如果其為單一的D-氨基葡萄糖鹽酸鹽化合物，扣除羥基及氨基活潑氫(實際檢測中會被重水氘代而不產生質子峰)數目，結構中只有7 個質子。而實際氫譜，以δH4.5 以上積分值約為1.0∶0.6 的2 組質子信號為參考，其余質子峰積分值分別接近1.0 或0.6 的整數倍，不再滿足同一整數比的關系;并且積分總加和值接近1.6 的7 倍;同樣，樣品170 的1H NMR 譜也呈現出類似情況。

實際采集到的13C NMR 譜中分別有11 和16 個碳峰信號，數量也均接近樣品383 和樣品170 化學結構中實際碳原子個數的2 倍。

基于以上分析，判斷2 個待測樣在D2O 溶液中并非以單一化合物形式存在，和D-葡萄糖一樣在溶液中發生變旋［22］，轉化為α，β 兩種構型的端基異構體。而兩種構型的存在加劇了氫譜信號重疊。

2.2 1D TOCSY 對溶液態構型混合物質子信號的分離與指認

選擇性1D TOCSY 技術能夠有效提取與激發核在同一耦合體系中、但相隔共價鍵數遞增(由近及遠)的不同位置質子信息，是簡化分解常規氫譜的有效方法。異頭質子處于糖環自旋耦合體系的起始位置，由于直接與2 個氧原子相連，其化學位移一般處于糖環區相對低場(δH5.5 ～4.5)，譜峰獨立，特征性鮮明，可選擇作為該方法提取同一糖環自旋體系其他質子位移信息的切入點。

圖1 樣品1H NMR 譜(D2O)

2.2.1 樣品383 的質子信號指認

基于存在2 種構型化合物的假設分析，待測樣383 氫譜低場的2 組質子信號δH5.39 (d，J = 3.5 Hz)和δH4.89 (d，J = 8.5 Hz)均符合異頭質子信號的特征。質子δH5.39 耦合常數較小(3.5 Hz)，應與相連的2 位質子成ae 或ee 鍵關系，即兩質子在糖環同側，因此其所屬化合物應為α 構型;而質子δH4. 89(d，8.5 Hz)與相鄰的2'位質子都處于a 鍵，兩質子分別指向糖環上下個方向，所屬化合物定為β 構型［20］。由積分值估計2 種構型化合物的含量比約為62∶38，與D-葡萄糖在水溶液中α，β 構型的比例37∶63 正好相反。

以δH5.39 (d，H1)為1D TOCSY 譜的激發中心，逐漸增大混合時間，屬于同一化合物383-α 糖環其他質子峰依次“接力”出現(圖2 (a-1)自上而下):δH3.24 (dd，H2)，δH3. 83 (dd，H3)，δH3. 43 (dd，H4)。由于與H3 重疊，無法按信號提取的先后次序定義信號δH3.83，δH3.73 和δH3.79 代表的質子位置，但HSQC 實 驗 數 據 顯 示δH3. 83 分 別 與δC69. 69 和δC71.56相關，表明δH3.83 確實為2 個不同質子信號的重疊;另外δH3.73 和δH3.79 為同碳質子峰，從而確定以下歸屬:δH3.83 (m，H5)，δH3.73 (dd，H6a)和δH3.79 (dd，H6b)。

以δH4. 89 (d，H1’)為激發中心，在系列1D TOCSY 譜(圖2(a-2))中剩余6 組積分值接近0.6 的質子峰依次“接力”出現:δH2.95 (dd)、δH3.64 (dd)、δH3.42 (dt)、δH3.45 (dt)，可依次歸屬為另一構型化合物383-β 上與H1'相隔共價鍵數遞增的2'位、3'位、4'位、5'位質子;最后同步出現的1D TOCSY 相關信號是δH3.85 (dd)與和δH3.69 (dd)，結合HSQC 結果定為6'位亞甲基的2 個同碳質子峰。

圖2 樣品的1D TOCSY 圖組(D2O)

2.2.2 樣品170 的質子信號指認

樣品170 氫譜中δH5. 13 (d，J = 3. 5 Hz)和δH4.64 (d，J = 8.5 Hz)符合異頭質子信號的特征。結合耦合常數同樣可判斷，質子δH5.13 所屬化合物為1，2 位ae 或ee 鍵關系的α 構型，δH4.64 所屬化合物則為1，2 位aa 鍵關系的β 構型。由2 組信號的積分值估計這2 種構型化合物的含量比約為55∶45，與上述D-氨基葡萄糖相比，雖然還是α 構型的較多，但兩種構型的比例更為接近。

1D TOCSY 系列譜中，以δH5.13 (d，H1)為激發中心(圖2(b-1))，按構型化合物170-α 的糖環上其他質子產生的先后順序歸屬出:δH3. 80 (dd，H2)，δH3.69 (t，H3)，δH3.42 (dd，H4)，δH3.78 (m，H5)，δH3.71 (dd，H6a)和δH3.78 (m，H6b);以δH4. 64(d，H1')為激發中心(圖2(b-2))，構型化合物170-β的糖環其他質子位移依次為:δH3. 60 (dd，H2')，δH3.46 (dd，H3')，δH3. 39 (m，H4')，δH3. 39 (m，H5')，δH3.67 (dd，H6a')和δH3.84 (dd，H6b')。其中在1D TOCSY 系列激發實驗中，δH3.78 和δH3.39 處信號產生時，均是隨混合時間的增加峰強度連續明顯增強。依據2 個異頭質子積分值之比約為1.0∶0.8，分析氫譜δH3.90 ～3.75、δH3.75 ～3.65、δH3.50 ～3.35三段信號的分組積分值，基本可判斷位移δH3.78 和δH3.39 處均分別重疊了2 個質子，即H5 和H6、H4'和H5'的質子峰分別存在重疊。后期HSQC 數據顯示，δH3.78 與δC60.59、δC71.56，δH3.39 與δC69.84、δC75.95均同時存在相關，從而進一步驗證了以上結論。

2.3 NMR 結構解析和驗證

在利用系列1D TOCSY 基本完成了質子信息全指認的基礎上，結合DEPT135、HSQC 實驗數據，待測樣383 和170 的13C NMR 譜的所有連氫碳的位移信息也均一一得到有效指認(見表1)。HMBC 實驗結果顯示2 個樣品共4 種構型異構體的1 位和5 位之間均存在遠程氫、碳耦合關系，證明化合物確實成糖環結構;同時其他HMBC 數據也驗證了TOCSY 技術指認糖環區氫位移順序的正確性。另樣品170 的碳譜信息顯示其2 個構型化合物結構中分別還含有一個羰基和一個甲基片段，但HMBC 數據表明季碳δC174.51 與質子峰δH4.642 (2 位)、δH1.979 (s，3)，δC174.75 與質子峰δH4.642(2'位)、δH1.977 (s，3)分別存在遠程相關信息，從而170 中各個構型化合物在2 位氨基上連接的乙酰基片段的碳氫位移信息得以確定。

表1 樣品383(D-氨基葡萄糖鹽酸鹽)和170(N-乙酰-D-氨基葡萄糖)的相關核磁信息指認(D2O)

此外，借助系列選擇性1D TOCSY 實驗對常規氫譜做“分解”后，各組質子信號的精細裂分也得以識別。測得2 個樣品共4 種構型異構體的2 位-5 位質子的耦合常數值基本為8 ～11 Hz，表明4 個化合物2 位/3 位，3 位/4 位，4 位/5 位質子均處于直立鍵(a 鍵)的位置，為aa 耦合;這也說明2 和4 位質子同在糖環一側，3 和5 位質子同在糖環另一側。另外可以根據1，2位質子間耦合常數推斷170，383 中兩中異構體的構型:當異構體中1，2 位質子間耦合常數較小(3.5 Hz)時屬ae 鍵或ee 鍵耦合，而2 位質子處于直立鍵(a鍵)，所以可確定1 位質子處于平伏鍵(e 鍵)的位置，該異構體為α-構型;當異構體中1，2 位質子間耦合常數較大(8.5 Hz)時屬aa 鍵耦合，兩質子均處于直立鍵(a 鍵)的位置，因此該異構體為β-構型。

綜合以上核磁數據解析，可確定待測樣383 和170 分別是D-氨基葡萄糖鹽酸鹽和N-乙酰-D-氨基葡萄糖，溶解于重水后分別轉化為1/2 位氫分別處于a鍵/e 鍵和a 鍵/a 鍵2 種形式的化合物，即產生α 和β兩種構型化合物(見圖3)。2 個樣品共4 種構型異構體的核磁結構信息均得以完整指認。

圖3 樣品383 和170 構型異構體的化學結構

3 結 語

本文利用1D TOCSY 技術，通過優化整形脈沖的混合時間，使得與異頭質子在同一糖環自旋體系、相隔共價鍵數遞增的質子，其信號依次“接力”出現。獲得的選擇性1D TOCSY 系列譜，相當于對復雜重疊的常規氫譜進行了有效分解，并且“分解譜”中大多數信號均能清晰呈現出原本的精細峰型結構，為核磁解析提供了更明確和豐富的幫助信息，使得D-氨基葡萄糖鹽酸鹽和N-乙酰-D-氨基葡萄糖在水溶液中的兩種構型結構得以完全確認，大大簡化了對不同構型化合物質子信號分組歸屬和核磁信息全指認的流程。該思路對于核磁共振在快速解析碳水化合物中多糖環、在溶液中會發生變旋的糖類混合物等結構，能夠提供一定的參考。

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