閉鎖小帶蛋白-1在腦外傷后皮質中的表達變化

王濤，孟穎，鄒冬華，李正東，陳憶九，陶陸陽

（1.司法部司法鑒定科學技術研究所上海市法醫(yī)學重點實驗室，上海 200063；2.蘇州大學醫(yī)學部法醫(yī)學系，江蘇蘇州 215123；3.蘇州高新區(qū)人民醫(yī)院ICU，江蘇蘇州 215129）

閉鎖小帶蛋白-1在腦外傷后皮質中的表達變化

王濤1，2，孟穎3，鄒冬華1，李正東1，陳憶九1，陶陸陽2

（1.司法部司法鑒定科學技術研究所上海市法醫(yī)學重點實驗室，上海 200063；2.蘇州大學醫(yī)學部法醫(yī)學系，江蘇蘇州 215123；3.蘇州高新區(qū)人民醫(yī)院ICU，江蘇蘇州 215129）

目的觀察閉鎖小帶蛋白-1（zonula occludens-1，ZO-1）在腦外傷后皮質中不同時段的表達變化。方法建立小鼠腦外傷模型，分為腦外傷后1h、3h、6h、12h、24h、3d、7d組，同時設立假手術組及正常對照組。腦皮質中伊文思藍（Evans blue，EB）含量檢測評估血腦屏障通透性，Western印跡法和免疫組織化學染色法檢測損傷皮質區(qū)ZO-1的表達。結果腦外傷后1h皮質中EB含量開始增加，傷后1～3d達高峰，傷后7d接近正常。Western印跡法顯示，ZO-1在損傷1h后表達下調，損傷1～3d達到最低值，損傷7d后明顯回升，但仍低于假手術組和正常對照組。免疫組織化學染色顯示，正常腦皮質血管中ZO-1呈強陽性表達，損傷后表達逐漸減弱，損傷3d后陽性表達幾乎消失，之后逐漸恢復。結論ZO-1在腦外傷后皮質區(qū)呈先降低后升高的表達規(guī)律，與腦外傷后血腦屏障通透性變化規(guī)律呈負相關，為推斷腦外傷損傷時間提供了新指標。

法醫(yī)病理學；腦損傷；閉鎖小帶蛋白-1；小鼠

血腦屏障對于維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)內環(huán)境的穩(wěn)定具有重要意義，腦微血管內皮細胞之間的緊密連接是血腦屏障結構與功能的基礎[1]。目前研究發(fā)現(xiàn)，胞質附著蛋白、跨膜蛋白及細胞骨架蛋白共同組成了緊密連接，其中胞質附著蛋白是緊密連接結構的基礎，包括閉鎖小帶（zonula occludens，ZO）蛋白家族[2]。已有文獻[3]報道，損傷、缺血、缺氧、感染、免疫及理化因素等均可能引起緊密連接結構及功能發(fā)生改變造成血腦屏障損害，從而導致其通透性升高引起腦水腫。本研究通過建立小鼠腦外傷模型，觀察損傷后腦皮質ZO-1的表達變化，并檢測腦外傷后皮質中伊文思藍（Evans blue，EB）的含量變化，從而闡述腦外傷后腦水腫的形成機制，并為推斷腦外傷損傷時間提供新的指標。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

兔抗小鼠ZO-1多克隆抗體（ab59720，美國Abcam公司），兔抗小鼠GAPDH多克隆抗體（杭州賢至生物科技有限公司），辣根過氧化物酶（HRP）標記山羊抗兔IgG（H+L）（A0208，上海碧云天生物技術有限公司），兔SP檢測試劑盒（SP-9001，北京中杉金橋生物技術有限公司），伊文思藍（ab120869，美國Abcam公司），ECL試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）。

1.2 腦外傷模型的建立及分組

取健康成年雄性CD-1小鼠81只（體質量25～30g，購于上海SLAC實驗動物有限公司）。隨機取63只進行建模：4%水合氯醛（1 mL/100 g）腹腔麻醉小鼠，采用改良的自由落體打擊法，建立小鼠腦外傷模型[4]。隨機分為腦外傷后1h、3h、6h、12h、24h、3d、7d組，每組9只。同時設立假手術組及正常對照組各9只。假手術組只開顱暴露硬腦膜，不進行打擊損傷，正常對照組則不做任何處理。

每組小鼠中3只用于腦皮質中EB含量檢測，3只用于Western印跡法，3只用于免疫組織化學染色法。

1.3 EB含量檢測

小鼠腦皮質中EB含量測定的方法參照文獻[5]，并作改進。小鼠創(chuàng)傷性腦損傷后于處死前2 h尾靜脈注射2%EB，損傷后不同時間點4%水合氯醛麻醉后，用生理鹽水對小鼠進行心臟灌流，除去未結合的染料，斷頭處死，迅速取損傷腦皮質稱重，放入盛有3 mL甲酰胺的試管中，加上橡皮塞，60℃水浴中（避光）抽提48h，加溫1h后用細棒將浮在上面的腦組織輕輕壓沉，以便皮質中EB充分溶解出來。勻漿液以離心半徑9.35 cm，12 000 r/min，4℃，離心20 min，取200 μL上清液于96孔板中，用ELX800吸光酶標儀（美國BioTek公司）于620nm處測定吸光度。按公式計算腦皮質中EB含量，以EB含量（μg/g）代表血腦屏障通透性的改變。

EB（μg/g）=標準品EB質量濃度（μg/mL）×甲酰胺量（mL）/腦濕重（g）。

1.4 Western印跡法

小鼠損傷后在不同時間點腹腔麻醉，經(jīng)40mL生理鹽水心臟灌流后斷頭處死。取損傷周圍2mm腦皮質，-80℃保存。提取腦組織總蛋白，電泳后轉移至PVDF膜上，分別加入兔抗小鼠ZO-1（1∶500）和GAPDH （1∶1000）多克隆抗體，4℃孵育過夜，0.01mol/L PBS洗膜，HRP標記羊抗兔IgG（H+L）雜交，37℃孵育2 h，ECL試劑盒顯色后X線膠片顯像掃描，檢測ZO-1條帶光密度值，將其與GAPDH的比值作為相對表達強度。

1.5 免疫組織化學染色法

小鼠損傷后在不同時間點用4%水合氯醛腹腔麻醉，經(jīng)生理鹽水40 mL及4%多聚甲醛溶液40 mL心臟灌流后，斷頭取腦皮質放入4%多聚甲醛溶液后固定4h，0.01mol/L PBS漂洗3次后轉移至30%、20%、10%梯度蔗糖中脫水。冰凍切片（10μm），貼于載玻片上。采用SP法進行免疫組織化學染色，具體步驟按照試劑盒說明書。

1.6 圖像采集與數(shù)據(jù)分析

采用Scion Image 4.01軟件對Western印跡法檢測圖像進行采集與分析。在每張免疫組織化學染色切片中，于損傷側腦皮質取5個視野（×400）攝片。所有數(shù)據(jù)用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析及兩兩比較，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 EB含量檢測結果

腦外傷后1h皮質中EB含量開始增加，至損傷后1～3d達高峰，傷后7d逐漸降低并接近正常（表1）。

表1 腦外傷后皮質中EB含量 （n=3，±s）

表1 腦外傷后皮質中EB含量 （n=3，±s）

注：1）與正常對照組比較，P〈0.05

組別EB含量/（μg/g）ZO-1相對表達強度正常3.47±0.341.32±0.10假手術3.58±0.351.29±0.10傷后1h4.71±0.200.91±0.081）傷后3h5.92±0.311）0.80±0.051）傷后6h7.65±0.751）0.65±0.081）傷后12h8.97±0.521）0.57±0.071）傷后1d11.84±0.531）0.44±0.041）傷后3d13.94±0.491）0.34±0.061）傷后7d4.39±0.490.99±0.081）

2.2 Western印跡法結果

假手術組ZO-1表達水平與正常對照組相當，損傷1h后ZO-1表達開始下降，并于損傷1～3d達到最低值，損傷7d后ZO-1表達明顯回升，但仍低于假手術組和正常對照組（圖1、表1）。

圖1 腦外傷后皮質中ZO-1的表達變化

2.3 免疫組織化學染色結果

在假手術組和正常對照組腦皮質中可見明顯的ZO-1免疫染色陽性血管，染色血管多，染色深；傷后1 h出現(xiàn)免疫染色陽性血管減少，染色變淡，至傷后1～3d免疫染色陽性血管明顯減少，幾乎消失；至傷后7d免疫染色陽性血管逐漸增多，染色逐漸變深，但仍低于假手術和正常對照組（圖2）。

圖2 腦外傷后皮質中ZO-1免疫組織化學染色結果SP×400

3 討論

創(chuàng)傷性腦損傷，又稱腦外傷，是指一類由外傷導致腦組織嚴重損害的疾病，具有高發(fā)生率、高致殘率及高致死率等特點[6]，目前已成為影響人類健康的主要原因，已引起國內外醫(yī)學界的高度關注和廣泛研究。外傷后繼發(fā)性腦水腫是腦外傷后最常見的一種繼發(fā)病變，常引起顱內壓增高和腦血流灌注減少，加重腦組織缺氧缺血，從而形成惡性循環(huán)，最終造成腦組織不可逆的損壞，是顱腦損傷患者致死和致殘的主要原因[7]。繼發(fā)性腦水腫主要分為兩種類型，細胞毒性水腫（細胞內水腫）和血管源性水腫（細胞外水腫）。研究表明[1，8]，血管源性腦水腫的形成與血腦屏障完整性破壞密切相關。完整的血腦屏障由腦微血管內皮細胞、神經(jīng)元、星形膠質細胞、周細胞以及包繞腦微血管內皮細胞的基底膜構成[8]，只允許小分子物質通過，當血腦屏障發(fā)生破壞時，血管內的大分子物質可通過血腦屏障滲出到細胞外間隙，從而形成血管源性腦水腫。EB與血漿蛋白結合不能通過完整的血腦屏障，當血腦屏障遭受破壞，通透性增大時，EB-血漿蛋白復合物可通過損傷的血腦屏障滲出到血管外，因此可通過檢測外源性注射的EB在損傷區(qū)腦組織的含量評估血腦屏障的通透性[9]。本實驗通過檢測腦外傷后不同時間段皮質中EB的含量發(fā)現(xiàn)，腦外傷后1h即發(fā)生血腦屏障的破壞，1～3d時血腦屏障破壞最為嚴重，并于7d逐漸修復。這也印證了前期實驗結果[10]，腦外傷后腦水腫在傷后1～3d到高峰，之后逐漸恢復。

近年來的研究發(fā)現(xiàn)[1，8]，顱腦損傷后腦微血管內皮細胞之間的緊密連接蛋白對維持血腦屏障結構與功能發(fā)揮重要作用。ZO-1是第一個被證實的緊密連接胞質附著蛋白，相對分子質量約220000，隨后ZO-2和ZO-3亞型被發(fā)現(xiàn)，ZO-1與“衛(wèi)星分子”ZO-2、ZO-3組成ZO-1/ZO-2/ZO-3復合體，具有3個PDZ結構域，即盤狀同源區(qū)域[2]。ZO-1/ZO-2/ZO-3復合體通過PDZ結構域與claudin的C端相互作用，并通過C端與肌動蛋白相互作用，將跨膜蛋白和細胞骨架蛋白連接在一起，從而發(fā)揮“腳手架”的功能，對維持血腦屏障的結構完整和功能發(fā)揮起至關重要的作用[11]。由于ZO-1對于各種影響血腦屏障功能的刺激敏感，使其成為一種顯示緊密連接功能正常與否的可靠標志。本研究中，Western印跡法檢測結果顯示損傷后ZO-1表達逐漸減少，并于損傷后1～3 d達到最低值，之后逐漸回升；免疫組織化學染色結果表明在正常腦皮質血管中ZO-1呈高強度表達，腦外傷后皮質中血管遭受破壞，ZO-1表達減弱，并于腦外傷3d后表達明顯減弱，甚至消失，之后逐漸恢復。上述實驗結果表明，腦外傷后ZO-1呈現(xiàn)先降低后升高的表達規(guī)律，與腦外傷后腦水腫的變化規(guī)律呈負相關，這與腦外傷后血腦屏障的完整性遭受破壞存在直接關系。

顱腦損傷是法醫(yī)學檢驗中最常見的死亡原因，除研究顱腦損傷的死亡機制外，準確推斷顱腦損傷時間一直是法醫(yī)工作者研究的難點和熱點之一。本研究中Western印跡法檢測結果與免疫組織化學染色結果的變化規(guī)律一致，為腦損傷形成時間的推斷提供了新的參考指標。但尚未驗證ZO-1在實際檢案中不同時間腦損傷后腦組織的表達，且損傷程度及死亡時間是否會影響ZO-1的表達尚需進一步研究。

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Expression of Zonula Occludens-1 in Cerebral Cortex Following Traumatic Brain Injury

WANG Tao1，2,MENG Ying3,ZOU Dong-hua1,LI Zheng-dong1,CHEN Yi-jiu1,TAO Lu-yang2
（1.Shanghai Key Laboratory of Forensic Medicine,Institute of Forensic Science,Ministry of Justice,Shanghai 200063,China;2.Department of Forensic Medicine,Medical College of Soochow University,Suzhou 215123,China;3.Intensive Care Unit,Suzhou High-tech Zone People's Hospital,Suzhou 215129,China）

Objective To observe the time-course expression of zonula occludens-1（ZO-1）in cerebral cortex after traumatic brain injury（TBI）.Methods The TBI model of mouse was established.The mice were divided in 1 h,3 h,6 h,12 h,24 h,3 d,7 d after TBI,sham and control groups.The permeability of the blood brain barrier was evaluated by measuring the extravasation of Evans blue（EB）dye.The expression of ZO-1 in cerebral cortex in the injured area was detected by Western blotting and immunohistochemistry.Results The extravasation of EB dye of injured cortex gradually increased from 1h, peaked at 1-3 d and approximately decreased to normal at 7 d after TBI.Western blotting revealed that the expression of ZO-1 gradually decreased after 1h,was at the lowest at 1-3d,and then significantly increased after 7d but was still lower than that of normal and sham groups.The result of immunohistochemistry showed that ZO-1 had strong expression in vessel of normal cortex,gradually decreased after TBI,and almost disappeared at 3 d after TBI and gradually recovered to normal level later.Conclusion The expression of ZO-1 in the injured cortex after TBI initially decreases and then increases.The negative correlation between ZO-1 expression and EB extravasation after TBI could be used as a new indicator for wound age estimation.

forensic pathology;brain injuries;zonula occludens-1;mice

DF795.1

A

10.3969/j.issn.1004-5619.2015.02.002

1004-5619（2015）02-0085-03

2014-12-22）

（本文編輯：劉寧國）

“十二五”國家科技支撐計劃項目（2012BAK16B02）；國家自然科學基金資助項目（81273338、81172911）；上海市法醫(yī)學重點實驗室資助項目（14DZ2270800）；上海市博士后科研資助計劃項目（14R21423000）；蘇州市科技發(fā)展計劃項目（SZP201304）

王濤（1984—），男，安徽阜陽人，博士，主要從事顱腦損傷研究；E-mail：0253010217＠163.com

陳憶九，男，研究員，博士研究生導師，主要從事法醫(yī)病理學研究：E-mail：chenyj＠ssfjd.cn

通信作者：陶陸陽，男，教授，博士研究生導師，主要從事顱腦損傷及ERP研究；E-mail：luyang.tao＠163.com