Chelex-100法和QIAcube純化法在接觸性檢材檢驗中的比較

廖長青，成靜，劉維

（湘潭市公安局刑科所，湖南湘潭 411100）

Chelex-100法和QIAcube純化法在接觸性檢材檢驗中的比較

廖長青，成靜，劉維

（湘潭市公安局刑科所，湖南湘潭 411100）

法醫遺傳學；Chelex-100法；QIAcube純化法

在法醫DNA檢驗中，能否提取到足夠濃度與純度的DNA模板，是決定DNA檢驗成敗的關鍵之一。本研究分別采用Chelex-100法與QIAamp DNA Investigator試劑盒結合QIAcube核酸自動化提取儀（QIAcube純化法）提取實際檢案中的DNA，同等條件下進行PCR擴增與電泳，比較分析二者的圖譜，報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

65份接觸性生物檢材來自本實驗室日常檢案積累，其中瓶口32份，工具手柄18份，繩索衣物類15份。瓶口和工具手柄檢材均采用生物物證提取專用棉簽（公安部物證鑒定中心）干濕兩步法提取；繩索衣物類檢材采用脫落細胞粘取器（公安部物證鑒定中心）粘附提取。

1.2 DNA提取

1.2.1 Chelex-100法

取檢材適量，剪碎后放入0.5mL離心管中，加入適量Chelex-100懸濁液與蛋白酶K溶液，恒溫搖勻孵育儀（珠海博邁杰公司）上56℃孵育1.5h，煮沸10min，離心取上清液適量擴增。

1.2.2 QIAcube純化法

取檢材適量，剪碎后放入0.5mL離心管中，加入QIAamp DNA Investigator試劑盒（德國QIAGEN公司）中ATL裂解液300μL及蛋白酶K 20μL，恒溫搖勻孵育儀上56℃孵育1.5 h，再使用試劑盒提供的MinElute離心柱在QIAcube核酸自動化提取儀（德國QIAGEN公司）上純化提取DNA，洗脫體積30μL，取洗脫液適量擴增。

1.3 PCR擴增與STR分型

使用AmpFLSTR?Identifiler?Plus試劑盒（美國AB公司）在9700型PCR擴增儀（美國AB公司）上擴增，反應體系10 μL，循環30次。擴增產物在3130XL遺傳分析儀（美國AB公司）上電泳檢測，使用GeneMapper ID v3.2.1分析數據，圖譜峰高識別閾值為50RFU。

2 結果

對上述檢驗圖譜進行統計，可以看出兩種提取方法的提取產物經同樣的擴增、檢測，QIAcube純化法所得結果要明顯優于普通的Chelex-100法。按等位基因檢出數的不同，統計結果見表1。

表1 兩種提取方法的STR分型結果（等位基因檢出數）［例（%）］

瓶口檢材無論采用Chelex-100法還是QIAcube純化法均有較高的檢出率，尤其是使用QIAcube純化法時有90.63%的檢材可檢出9個以上等位基因，且峰高基本在1000RFU以上，多為單一來源，僅有2例混合斑。未檢出的3例均無瓶蓋保護，推測DNA降解毀損嚴重。

工具手柄擦拭子與繩索衣物類檢材使用Chelex-100法提取，檢出率均不高，尤其是繩索衣物類檢材使用脫落細胞粘取器粘取后直接用Chelex-100法提取時僅13.33%的檢材可檢出9個以上等位基因。使用QIAcube純化法提取，兩者的檢出率均有明顯提高，但峰高基本在2000RFU以下，而且來源復雜，多檢出混合基因圖譜。

3 討論

Chelex-100是一種由苯乙烯和二乙烯基苯共聚體組成的化學螯合樹脂，可以螯合多價金屬離子，尤其是選擇性螯合二價離子（如鎂離子），使體系中降解DNA的核酸酶失活，從而保護DNA分子。Chelex-100法提取DNA，在同一管中操作，因此檢材的損失率低，相對不容易污染，操作簡便快速，價格低廉，對試劑設備的要求低，廣泛適用于常規物證的DNA提取[1]。楊電等[2]用小體積Chelex-100法提取微量口腔脫落細胞檢材DNA進行STR分型，9個以上STR位點分型成功率在60%左右，與筆者使用Chelex-100法提取瓶口56.25%的成功率相當。但此方法將DNA檢材的載體、核膜及其他試劑一起保留在同一離心管中，不能有效去除雜質，降低了DNA的純度，可能抑制下游的PCR擴增，從而導致檢出率下降。暢晶晶等[3]分別采用6種不同的方法提取全血DNA，通過試驗證明常規Chelex-100法所得DNA模板的純度較低。因此Chelex-100法通常只適用于污染輕、雜質少、DNA含量高、載體體積小的常規檢材的DNA提取，而在污染、腐敗、微量檢材的處理上存在很大的局限性。如筆者使用該方法處理工具手柄及繩索衣物類檢材時，檢出率較低，分別為33.33%、13.33%，明顯低于QIAcube純化法的72.22%、80.00%。

QIAamp DNA Investigator試劑盒使用的MinE-lute離心柱，上面的硅膠膜既能與DNA硅膠膜特異性結合，又能濾去大顆粒雜質與可溶性PCR抵制物，最后使用小體積ATE緩沖液洗脫，得到不含蛋白質、核酸酶和抑制劑的DNA濃縮液，有利于下游的PCR擴增。QIAcube核酸自動化提取儀將上述裂解、結合、清洗、洗脫操作流程實現標準化、封閉化、全自動化，避免人為操作帶來的誤差、污染等問題，使DNA檢驗快速、準確、可重復。從DNA提取的原理來看，QIAcube純化法能更有效地釋放DNA，而且可以有效去除模板DNA中的雜質，同時兼具濃縮富集功能，因而可以獲得更純、濃度更高的DNA模板。從實際檢驗效果來看，使用該方法提取DNA不僅檢出率明顯高于Chelex-100法，而且其圖譜峰高也明顯高于Chelex-100法。此外，對于純化過的微量DNA樣本，通常使用小體系平行擴增同時適當增加循環次數來提高其檢測的靈敏度[4]，但同時也會伴隨著等位基因插入、等位基因丟失、stutter產物增加等問題，需要謹慎判別圖譜。

[1]鄭秀芬.法醫DNA分析[M].北京：中國人民公安大學出版社，2002：38-39.

[2]楊電，劉超，徐曲毅，等.微量口腔脫落細胞檢材的DNA檢驗[J].法醫學雜志，2008，24（2）：126-128.

[3]暢晶晶，張素華，李莉.全血中DNA 6種提取方法的比較[J].法醫學雜志，2009，25（2）：109-111，114.

[4]張璐，王保捷，丁梅，等.循環次數與體系對DNA檢測靈敏度的影響[J].法醫學雜志，2013，29（2）：125-126.

DF795.2

B

10.3969/j.issn.1004-5619.2015.02.018

1004-5619（2015）02-0148-02

2013-12-18）

（本文編輯：李成濤）

廖長青（1982—），男，湖南懷化人，主檢法醫師，主要從事法醫物證檢驗及鑒定工作；E-mail：35046786＠qq.com