野生花生全基因組抗病相關LOX基因的生物信息學分析

宋輝　趙術珍　侯蕾　喬善良　趙傳志　李愛芹　王興軍

摘要：脂肪氧合酶（lipoxygenases，LOX）是生物體內一種重要的雙加氧酶，其在植物發育以及響應生物和非生物脅迫時發揮重要作用。本研究從Arachis duranensis和Arachis ipaensis兩個野生花生基因組中各鑒定出18個LOX基因，分別命名為AdLOX1～18和AiLOX1～18。在AdLOX5、AdLOX7、AiLOX8和AiLOX18基因的CDS序列中發現提前終止翻譯的終止密碼子，而AiLOX9基因的CDS序列過短，推測這些基因可能是假基因。染色體定位結果顯示，AdLOX和AiLOX基因主要分布在2、3、6、8、9和10號染色體上，且其直系同源基因分布在兩套染色體相同或相近的位置。通過分析AdLOX和AiLOX基因與已知功能LOX基因的親緣關系發現，AdLOX6、、AdLOX9、AdLOX11、AdLOX12、AdLOX17、AiLOX1、AiLOX4、AiLOX6、AiLOX16和AiLOX17基因可能參與花生的抗病過程，啟動子分析結果也支持這一結論。基因選擇壓力研究表明，AdLOX和AiLOX基因在進化歷程中受到純化選擇。

關鍵詞：野生花生；LOX基因家族；抗病；系統發育；選擇壓力

中圖分類號：S656.201

文獻標識號：A

文章編號：1001-4942（2015）10-0001-07

花生（Arachis hypogaea L.）作為重要的油料經濟作物被廣泛地種植在熱帶和亞熱帶地區。目前，花生屬中已經鑒定了80個種。大多數的野生花生為二倍體，而栽培花生為異源四倍體（AABB）植物。大量研究表明，栽培花生的二倍體祖先分別是提供A基因組的Arachis duranensis和提供B基因組的Arachis ipaensis。栽培花生對多種病蟲害的抗性低，近年來，病蟲害危害嚴重，造成花生大面積減產。而野生花生由于長期適應不同的惡劣環境，對病蟲害有很高的抗性，甚至對有些嚴重影響栽培花生的病害免疫。因此，研究野生花生對病原菌的抗性機理，鑒定、挖掘野生花生中的抗病基因資源，對培育抗病能力強的優異花生新品種具有重要意義。2014年，A.duranensis和A.ipaensis全基因組測序工作已經完成，為從全基因組水平上分析和鑒定野生花生的抗病基因、研究其抗病機理奠定了堅實基礎。

LOX蛋白是一種非血紅素鐵酶（non-hemeiron containing enzymes），該酶廣泛地分布在動物、植物和微生物中。其主要功能是通過LOX途徑降低多不飽和脂肪酸（polyunsaturated fattyacids）的含量。在LOX途徑中，過氧化氫物（hydroperoxides）被轉化為氧化脂類（oxylipins），而氧化脂類能激活LOX途徑下游的多種酶，包括過氧化氫裂解酶（hydroperoxide lyase）、過氧化氫環化酶（peroxygenase）、丙二烯氧合酶（allene oxide synthase）和二乙烯基醚合酶（divinyl ether synthase）。在植物中，氧化脂類和其衍生物，例如茉莉酸和乙醛等，已經被證實參與植物的抗病和抗蟲等過程。因此，研究LOX基因對闡明植物的抗病和抗蟲機理具有重要的作用。在擬南芥（Arabidopsis thaliana）中，AtLOX2基因被確定參與茉莉酸途徑；當擬南芥受到生物脅迫時，AtLOX1基因的表達也會上調。栽培花生LOX基因在抗病方面的研究已有報道。Burow等克隆了栽培花生AhLOX1基因，當花生受到茉莉酸、傷害和曲霉侵染時，該基因的表達會顯著提高。在栽培花生成熟種子中過量表達AhLOX2和AhLOX3基因，會提高其抵御黃曲霉侵染的能力。但花生LOX基因家族的系統研究尚未見報道。

目前，關于LOX基因家族的分類主要有兩種方法。第一種方法是根據亞油酸（linoleic acid）被氧化的順序分為9-LOX（C-atom 9）和13-LOX（C-atom 13）。第二種方法是根據氨基酸序列的相似性將LOX基因分為Type I-LOX和TypeⅡ-LOX，Type I-LOX的序列相似性約為75%，其N段缺少一段葉綠體運輸多肽；而TypeⅡ-LOX的序列相似性約為35%，其N段存在葉綠體運輸多肽，且具有13-LOX活性。

本研究利用生物信息學方法從A.duranensis和A.ipaensis基因組中分別鑒定出18個LOX基因，從分子系統進化、染色體定位和選擇壓力方面對AdLOX和AiLOX基因進行了系統的分析，并參考已報道的參與植物免疫過程的LOX基因，預測了在A.duranensis和A.ipaensis中參與植物免疫反應的LOX基因。

1材料與方法

1.1二倍體野生花生LOX基因序列的獲得

從花生基因組計劃網站（http：//peanutbase.org/）下載A.duranensis和A.ipaensis基因組序列。以A.duranensis和A.ipaensis的氨基酸序列作為數據庫，使用Lipoxygenase結構域（PF00305.15）作為查詢序列，采用HMMER程序分別搜尋以上兩個物種的LOX氨基酸序列。將得到的所有序列重新提交到Pfam數據庫，剔除只含有Lipoxygenase結構域的序列，保留同時含有Lipoxygenase和PLAT/LH兩種結構域的序列。

1.2LOX基因的系統進化和染色體定位分析

為對AdLOX和AiLOX基因進行分類和明確其進化關系，本研究在NCBI數據庫中下載了單子葉植物大麥（Hordeum vulgare）、水稻（Oryza sativa）、玉米（Zea mays）和小麥（Triticum aestivum）以及雙子葉植物擬南芥、花生、大豆（Glycine max）、豌豆（Pisum sativum）和菜豆（Phaseolus vulgaris）的LOX基因信息，使用MEGA 6.0軟件對下載的LOX氨基酸序列及AdLOX和AiLOX氨基酸序列構建系統發育樹。系統發育樹采用鄰接法（NJ），自舉值（bootstrap）設置為1000。另外，為挖掘兩種二倍體野生花生LOX基因的直系同源基因，使用AdLOX和AiLOX氨基酸序列構建系統發育樹，如果AdLOX和AiLOX聚集在系統發育樹末端的同一個分支上，則認為該基因對為直系同源基因。endprint

AdLOX和AiLOX基因在染色體上的定位信息從公布基因組序列的在線數據庫http：//pea-nutbase.org/獲得。使用MapInspect軟件（http：//mapinspect.software.informer.com/）構建基因的染色體定位圖。

1.3LOX基因啟動子順式作用元件分析

順式作用元件（cis-acting element）位于轉錄起始位點的上游區域，具有調控基因表達的功能。為預測抗病相關LOX基因的順式元件，本研究使用在線數據庫PlantCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）作為分析工具、以轉錄位點上游2000bp序列作為分析序列進行分析。

1.4選擇壓力分析

基因在長期的進化過程中經受不同的選擇壓力。評價基因在進化中所受選擇壓力的參數主要有兩個：同一性替換（synonymous substitution，Ks）和非同一性替換（Non-synonymous substitution，Ka）。如果Ka/Ks>1，則表示受正選擇壓力；Ka/Ks=1，表示受中性選擇；Ka/Ks<1，表示受純化選擇。本研究使用PAML程序的位點模型（site model）分別計算AdLOX和AiLOX蛋白在進化中所受的選擇壓力。設置M0（one ratio）、M1a（neutral）、M2a（selection）、M3（discrete）、M7（β）和M8[（β+ω）>1]6種計算模型，根據LRT的值判斷在M1a vs M2a、M0 vs M3和M7 vs M8下的選擇壓力。

2結果與分析

2.1LOX基因的鑒定與分類

本研究使用HMMER程序共檢測到23條AdLOX和25條AiLOX氨基酸序列含有Lipoxygenase結構域。先前的研究已經證實，只有同時含有Lipoxygenase和PLAT/LH結構域的序列才為LOX基因家族。使用Pfam數據庫分析23條AdLOX和25條AiLOX氨基酸序列發現，18條AdLOX和18條AiLOX氨基酸序列同時含有以上兩個結構域。根據測序的ID號，分別將AdLOX和AiLOX序列命名為AdLOX1～18和AiLOX1～18。進一步分析CDS和氨基酸序列證實，AdLOX5、AdLOX7、AiLOX8和AiLOX18的CDS序列中均含有提前終止翻譯的終止密碼子；AiLOX9的CDS序列長度只有525bp。推測以上序列可能是假基因或由于測序質量導致，在本研究中不對以上序列進行分析。余下16條AdLOX的CDS序列長度在1530～4374bp之間，氨基酸長度為509～1457aa；15條AiLOX的CDS序列長度為1737～2793bp，氨基酸序列長度為578～930aa（表1）。

LOX基因家族可以分為2個亞族，即9-LOX和13-LOX，根據其氨基酸結構可以進一步將13-LOX分為兩類，即Type I 13-LOX和TypeⅡ13-LOX。使用單子葉植物大麥、水稻、小麥和玉米以及雙子葉植物擬南芥、大豆、菜豆和豌豆的LOX氨基酸序列與野生花生AdLOX和AiLOX氨基酸序列構建系統發育樹，結果表明，AdLOX分別含有3個9-LOX、8個Type I 13-LOX和5個TypeⅡ13-LOX類型基因。AiLOX分別含有2個9-LOX、7個Type I 13-LOX和6個TypeⅡ13-LOX基因（圖1）。此外，Type I 13-LOX的分支中僅含有雙子葉豆科植物LOX基因，而9-LOX和TypeⅡ13-LOX分支中同時含有雙子葉植物和單子葉植物LOX基因，表明Type I13-LOX類型基因是在豆科植物分化以后形成的，而9-LOX和TypeⅡ13-LOX類型基因是在單子葉植物和雙子葉植物分化之前已經出現。

由系統發育樹可知，AdLOX和AiLOX基因與AtLOX1、AtLOX3、AtLOX4、AtLOX5、GmLOX4、OsLOX10、PsLOXG、PvLOX1、PvLOX1b和PvLOX2b的親緣關系較近（圖1）。其中，AtLOX1與AdLOX6、AdLOX9和AiLOX17聚集在一個分支；AtLOX3和AtLOX4與AiLOX1和AiLOX16聚集在一個分支；AtLOX5與AdLOX12和AiLOX4聚集在一個分支。研究發現，AtLOX1和AtLOX5的表達能提高植物體對病原菌和蚜蟲的抗性，而AtLOX3和AtLOX4的過量表達能提高植物對線蟲的抗性。由此推斷，AdLOX6、AdLOX9、AdLOX12、AiLOX1、AiLOX4、AiLOX16和AiLOX17基因可能參與野生花生的免疫反應。在栽培花生中已確定AhLOX2和AhLOX3基因參與花生的抗病過程。在系統發育樹中，AhLOX2和AhLOX3基因和AdLOX11、AdLOX17以及AiLOX6聚集在同一個分支上，由此推測，AdLOX11、AdLOX17和AiLOX6也可能在野生花生抗病過程中起著重要作用。先前的研究證實，PvLOX1基因在植物的發育過程中起一定的作用，AdLOX2和AiLOX14基因與其聚集在同一個分支，由此判斷這兩個基因也可能具有相似的功能；而GmLOX4、OsLOX10、PsLOXG、PvLOX1b和PvLOX2b基因的功能尚不完全明確，與這些基因聚集在一起的AdLOX和AiLOX基因的功能需要進一步的驗證。

2.2LOX基因染色體定位

二倍體野生花生共有10條染色體。根據AdLOX和AiLOX基因在染色體上的定位信息可知AdLOX基因分布在6條染色體上，分別是2、3、6、8、9和10號染色體；AiLOX基因分布在7條染色體上，分別是2、3、4、6、8、9和10號染色體（圖2）。AdLOX基因在9號染色體上分布的最多，有8個成員；其次，3和8號染色體上分別有3個AdLOX基因；6號染色體上含有2個AdLOX基因；而2和10號染色體上分別有1個AdLOX基因。于此相似，AiLOX基因在9號染色體上分布最多，共有7個；3和6號染色體上各3個；8號染色體上2個；2、4和10號染色體上各分布1個AiLOX基因。進一步分析表明，AdLOX和AiLOX基因在9號染色體上成簇集中分布，其中在A基因組的9號染色體和B基因組的9號染色體6.3Mb和10.2Mb的范圍內各有6個LOX基因（表1和圖2），表明9號染色體是LOX基因的起源位點。該結果對野生花生與栽培花生近緣雜交、野生種質抗病基因資源的利用以及分子標記輔助選擇具有重要指導意義。endprint

通過使用系統發育樹法共鑒定出12對AdLOX和AiLOX基因的直系同源基因對（圖3）。A.duranensis和A.ipaensis直系同源基因對分別分布在2、3、6、8和9號染色體上，其中9號染色體上分布的最多，有6對；3和8號染色體上各有2對，2和6號染色體上各有1對。對直系同源基因對的分析發現，這些基因對對應于A.duranensis和A.ipaensis染色體上相同或相似的位置，且其結構域保守，表明這些基因在功能上也相對保守；相反，有些在兩套染色體相同或相近位置上的基因卻不存在直系同源關系，如AdLOX5和AiLOX13（圖2），可能這些基因對在進化過程中發生了變異，或已分化出不同的生物學功能。

2.3啟動子抗病相關順式作用元件分析

通過分析AdLOX和AiLOX順式作用元件發現，所有預測到參與抗病過程的AdLOX和AiLOX基因的啟動子區域均含有參與抗病響應的順式作用元件，包括Box-W1、CGTCA-motif、TC-richrepeats、TCA-element和TGACG-motif，主要參與真菌誘導響應、茉莉酸途徑、免疫防御響應和水楊酸途徑（表2）。在10個抗病相關的LOX基因中，除了AdLOX9，其他9個基因均含有響應水楊酸或茉莉酸的順式作用元件。茉莉酸途徑主要響應死體型病原菌（necrotrophic pathogen）的侵入，而水楊酸途徑主要響應活體營養性病原菌（biotrophic pathogen）的侵入。雖然茉莉酸和水楊酸途徑響應不同類型病原菌的侵入，但也有研究表明，這兩種植物激素在防御病原菌侵入的過程中具有協同效應（synergistic effect）。參與抗病反應的AdLOX和AiLOX基因具有響應水楊酸和（或）茉莉酸途徑的順式作用元件，表明AdLOX和AiLOX基因能抵御多種病原菌的侵入。

2.4選擇壓力分析

為了檢測哪種選擇壓力影響AdLOX和AiLOX基因的結構（或功能），本研究使用PAML程序中的位點模型分別計算了AdLOX和AiLOX蛋白所受的選擇壓力。由表3可知，大多數Ka/Ks<1，且未檢測到正選擇位點，表明AdLOX和AiLOX基因在進化過程中受到純化選擇。純化選擇會使基因的結構和生物學功能更加保守。Chen等對毛果楊（Populus trichocarpa）LOX基因在進化過程中所受到的選擇壓力研究發現，大多數旁系同源基因對Ka/Ks<0.4，表明這些基因在進化歷程中受到純化選擇。這些結果表明，LOX基因可能在蛋白質水平上的進化相對緩慢。

3結論

本研究利用生物信息學方法對兩個野生花生種的LOX基因家族進行了鑒定和分類，共確定了18個AdLOX和18個AiLOX基因。通過分子系統發育關系分析發現，AdLOX6、AdLOX9、AdLOX11、AdLOX12、AdLOX17、AiLOX1、AiLOX4、AiLOX6、AiLOX16和AiLOX17基因可能參與植物體的抗病過程，其中，直系同源基因的功能相對保守。AdLOX和AiLOX基因在進化過程中受到純化選擇作用。endprint