生牛乳中金黃色葡萄球菌的分離鑒定與藥物敏感性分析

王文博　谷曉紅　苑學霞　李瑞菊　梁京蕓　李鴛鴦

摘要：采用金黃色葡萄球菌測試片快速篩選的方法，對采集于陜西省西安市和渭南市20份樣品中S.aureus進行分離鑒定及藥物敏感性研究，以了解此地區生牛乳中S.aureus的污染情況及對藥物敏感性。結果表明：S.aureus測試片可用于大量生牛乳樣品中S.aureus的初篩工作，方便且省力；S.aureus的檢出率為10%；檢出的兩株S.aureus對青霉素都為耐藥，其中一株對磺胺異惡唑也表現為耐藥，兩株S.aureus對復方新諾明、紅霉素、萬古霉素、氧氟沙星、克林霉素都表現為敏感。牛場應根據藥物敏感性實時調整抗感染藥物的使用方案。

關鍵詞：金黃色葡萄球菌；分離鑒定；藥物敏感性；生牛乳

中圖分類號：S879.1

文獻標識號：A

文章編號：1001-4942（2015）10-0092-03

金黃色葡萄球菌是一種常見的革蘭氏陽性病原菌，是引起反芻動物乳房疾病最普遍的致病菌，主要表現為奶牛和羊的臨床和亞臨床乳房炎。據報道，在奶牛場中，臨床型乳房炎的發病率為2%～8%，隱性乳房炎的發病率更高，這種牛生產的生鮮乳是易被S.aureus污染的食品原料，并且S.aureus能產生高溫滅菌不能破壞的腸毒素，將會嚴重影響消費者的身體健康。因此，對生牛乳中S.aureus的研究尤其是檢測非常重要。隨著抗生素的廣泛使用，S.aureus對目前使用的各種抗生素可能產生一定程度的耐藥，給奶牛乳房炎的治療帶來一定困難，所以及時掌握S.aureus的耐藥性情況是防治該病的關鍵。

本試驗以生牛乳為原料，以S.aureus為研究對象，采用S.aureus測試片進行快速篩選的方法，研究生牛乳中S.aureus的分離鑒定及藥物敏感性，旨在為生牛乳中S.aureus的分離鑒定及藥物敏感性分析提供一種方便、省力的檢測方法，為及時防止由S.aureus引起的食源性疾病提供可靠的技術支持，也為原料奶的安全生產提供科學依據。

1材料與方法

1.1材料

生牛乳：采自陜西省西安市和渭南市，共20份樣品。將采集的生牛乳放入冰盒中保存，并在12h內分離樣品；S.aureus測試片：購自北京良潤生物科技有限公司；S.aureus標準菌株[CMCC（B）26003]：購自廣東省食品微生物安全工程技術研究開發中心；藥敏測試盒：購白天津金章科技發展有限公司；API staph試劑盒、葡萄球菌試劑盒，購自法國生物梅里埃公司。

主要培養基：7.5%氯化鈉肉湯、S.aureus顯色培養基、哥倫比亞血平板培養基，均購自廣東環凱微生物科技有限公司。

主要儀器：APILAB Plus系統（法國生物梅里埃）；生化培養箱（購自上海新苗醫療器械制造有限公司）。

1.2方法

1.2.1生牛乳在S.aureus測試片上初步篩選無菌操作取25mL生牛乳于225mL滅菌生理鹽水中，混勻；取1mL均勻放于S.aureus測試片中進行初篩，37℃培養24h，有藍色菌落生長為可疑陽性，沒有藍色菌落生長為陰性。同時設空白對照。

1.2.2菌株的分離純化及鑒定 取下有S.aureus可疑陽性菌落的測試片，置于無菌7.5%氯化鈉肉湯中，37℃培養24h。取一菌環肉湯劃線于金黃色葡萄球菌顯色培養基中，37℃培養24h，紫紅色為可疑菌落。挑取紫紅色可疑菌落，劃線于哥倫比亞血平板培養基，37℃培養24h。從哥倫比亞血平板上取菌落做成0.5個麥氏濃度的均勻菌懸液，填充API試劑條中，37℃培養24h，加入APILAB Plus系統判讀。

1.2.3藥敏試驗 采用微量肉湯稀釋法，試驗方法及結果判定按美國臨床實驗室標準化委員會（CLSI）2015年標準進行。

2結果與分析

2.1生牛乳在S.aureus測試片上初步篩選結果

陜西省西安市和渭南市20份生牛乳在S.aureus測試片上培養24h后發現，有3份樣品測試片出現藍色斑點，判斷為S.aureus陽性疑似菌落，菌落顏色明顯，界線清晰，與空白對照和陰性測試片差異明顯，篩查結果明顯且直觀，如圖1所示。

2.2菌株分離及生理生化鑒定

將3份有可疑菌落的測試片進一步培養、分離、純化，最終通過APILAB Plus判定為：S.aureus 2株，鑒定結果分別為：SX1%ID=97.8%，T=1.00；SX2%ID=98.1%，T=0.9；木糖葡萄球菌（S.xylosus）1株；S.aureus的檢出率為10%。結果表明，取下陽性快檢測試片后，采用與國標相同的培養基進行培養、分離、純化，結果可以很好地滿足生化鑒定的需要。

2.3藥敏試驗結果

采用目前國際通用的美國臨床實驗室標準化委員會（CLSI）2015年標準規定的微量肉湯稀釋法和結果判定方法，對分離得到的2株S.aureus進行藥敏試驗，結果見表1。表明，在7種抗生素中，兩株S.aureus對青霉素及SX2對磺胺異惡唑表現為耐藥，其他則表現為敏感。

3討論與結論

生牛乳中S.aureus的篩選分離通常按照GB4789.10-2010的方法，先將所有樣品富集培養，再在選擇性培養基上進行分離鑒定，工作量大，消耗人力、物力多。何源等對重慶市生牛乳中S.aureus的污染狀況調查、薛秀恒等對安徽生牛乳中S.aureus的污染狀況調查均采用以上方法。本試驗用S.aureus測試片進行初篩，培養的樣品由20個減少到3個，減少了后續培養的數量；操作方法只是將1mL稀釋10倍的樣品加到測試片上培養即可，操作非常簡便。該測試片對S.aureus的識別率為100%，對非葡萄球菌屬的抗干擾能力良好。對葡萄球菌屬的檢測發現，測試片對木糖葡萄球菌的抑制率約為80%。所以測試片上顯色的菌落仍需后續鑒定（以上數據由北京良潤生物科技有限公司提供）。在本試驗中經過測試片初篩后得到的3個可疑菌株最后有一株鑒定為木糖葡萄球菌，與北京良潤生物科技有限公司提供的數據吻合。說明本測試片不會出現假陰性，但可能會有假陽性出現。因此，本測試片可用于大量生牛乳樣品的S.aureus的初篩工作，以減少工作量。

世界范圍內，該菌在生牛乳中的檢出率有國家和地區的差異，檢出率在12%～79%不等，本試驗中生牛乳中S.aureus的檢出率為10%，這與重慶市（24.67%）、安徽省（16.7%）的研究結果差異較大，說明不同地區生牛乳中S.aureus污染狀況不同。林柏玲等研究發現，上海和天津兩個城市牛乳中S.aureus污染情況相差較大（上海為0，天津為26.09%），可能由于上海屬于比較現代化的大都市，企業的生產管理制度均比較嚴格，牧場的生產條件和周邊環境的要求較天津市高。這也說明只要對生產過程中每個環節進行嚴格監控，生牛乳的質量是可以得到保證的。

本試驗中兩株S.aureus對青霉素都為耐藥，對復方新諾明、紅霉素、萬古霉素、氧氟沙星、克林霉素都為敏感，可能因為在奶牛場的養殖過程中青霉素長期單一使用。分離于不同奶牛場的S.aureus對所選7種抗生素的耐藥性也不同，這與趙修龍等的研究結果一致，這主要與不同牛場的管理和預防性用藥有關。本試驗中復方新諾明、紅霉素、萬古霉素、氧氟沙星、克林霉素對兩株菌都有良好的抗菌作用，建議用于此地區奶牛隱性乳房炎的防治。建議奶牛場建立細菌藥敏動態數據庫，根據藥物敏感性，實時調整抗感染藥物的使用方案，有針對性地選用藥物，經常更換抗生素種類。endprint