黃曲霉漆酶基因HIGS載體的構(gòu)建及對(duì)花生的轉(zhuǎn)化

孫全喜　王云云　王秀貞　唐月異　吳琪　張青云　曹廣英　王傳堂

摘要：黃曲霉毒素污染嚴(yán)重影響著花生食品安全。通過常規(guī)育種的方式培育抗黃曲霉花生新品種進(jìn)展緩慢，效果也難如人意。HTGS（Host-Induoed Gene Silencing，寄主誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因沉默）技術(shù)是一種新興的RNA干擾技術(shù)，為培育抗病植物提供了可能。但該技術(shù)在花生上的應(yīng)用尚未見報(bào)道。為創(chuàng)造抗黃曲霉花生新品系，本研究利用該技術(shù)構(gòu)建了兩個(gè)黃曲霉漆酶基因（Lac1和Lac2）的HIGS載體，并試圖將其轉(zhuǎn)化到易感黃曲霉的花生品種粵油20中，獲得了轉(zhuǎn)Lac1基因的PCR陽(yáng)性種子。根據(jù)HIGS的原理，黃曲霉侵染后，轉(zhuǎn)基因花生中產(chǎn)生的dsRNA將抑制黃曲霉漆酶基因表達(dá)，從而使轉(zhuǎn)基因花生對(duì)黃曲霉產(chǎn)生抗性。基于該原理，下一步將對(duì)轉(zhuǎn)基因種子是否抗黃曲霉侵染進(jìn)行鑒定。本研究為利用HTGS技術(shù)探索黃曲霉漆酶基因與黃曲霉致病性的關(guān)系奠定了基礎(chǔ)，為培育抗黃曲霉花生品種提供了一條新思路。

關(guān)鍵詞：花生；黃曲霉；漆酶基因；寄主誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因沉默（HIGS）；遺傳轉(zhuǎn)化

中圖分類號(hào)：S565.203.53

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A

文章編號(hào)：1001-4942（2015）10-0008-05

花生是世界重要的油料作物和經(jīng)濟(jì)作物，特別在廣大發(fā)展中國(guó)家，是重要的食用蛋白源和食用植物油源。我國(guó)是世界花生生產(chǎn)和消費(fèi)大國(guó)，也是花生貿(mào)易大國(guó)。然而，花生易受黃曲霉菌侵染而產(chǎn)生黃曲霉毒素，嚴(yán)重影響著花生的食品安全。

黃曲霉侵染花生時(shí)，會(huì)誘導(dǎo)花生產(chǎn)生抗病反應(yīng)，釋放植保素（Phytoalexins）。花生不同品種中植保素的積累被認(rèn)為與抗病性有關(guān)。花生中的植保素主要是芪類化合物（Stilbenoids），此類化合物大部分具有抗真菌活性。而黃曲霉漆酶（Laccase）能夠降解芪類化合物，漆酶活性高低與黃曲霉致病性強(qiáng)弱有直接關(guān)系。

漆酶是一種含銅多酚氧化酶，廣泛存在于植物、高等真菌和一些細(xì)菌分泌物中。在高等植物中，漆酶主要與木質(zhì)素降解有關(guān)。另外一些研究認(rèn)為漆酶還與病原真菌的致病性相關(guān)。單寧酸（Tannic acid）是一種植保素，Kim等認(rèn)為，在板栗疫病菌（Cryphonectria parasitica）侵染過程中，漆酶的存在可以使致病菌對(duì)單寧酸的抗性提高，從而增強(qiáng)對(duì)該病原的易感性。此外，還有漆酶參與人類病原真菌致病性的研究報(bào)道。

RNA沉默（RNAi）是植物抵御病毒入侵的一種自然防御機(jī)制。植物RNAi信號(hào)不但可以在相鄰細(xì)胞間傳遞，而且可以通過維管束進(jìn)行遠(yuǎn)距離傳播，并且能夠跨越物種界限，由寄主傳遞給寄生的植物、線蟲、細(xì)菌、真菌或取食植物的昆蟲。通過在植物（寄主）中異源表達(dá)病原物或昆蟲（寄生物）目標(biāo)基因的dsRNA，可誘發(fā)RNAi特異沉默病原或昆蟲中目標(biāo)基因的表達(dá)。這種寄主誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因沉默（Host-In-duced Gene Silencing，HIGS）為作物抗病育種提供了新思路。

為研究HIGS技術(shù)在花生抗黃曲霉中的應(yīng)用效果，培育出抗黃曲霉花生新品種，本研究以黃曲霉漆酶基因作為HIGS靶標(biāo)，構(gòu)建其RNAi載體，對(duì)感黃曲霉花生品種粵油20進(jìn)行轉(zhuǎn)化，獲得了推斷轉(zhuǎn)化體。

1材料與方法

1.1試劑及材料

本研究所用花生材料為易感黃曲霉品種粵油20。大腸桿菌DH5α感受態(tài)、DNA分子量標(biāo)記、PCR Mix等購(gòu)自北京全式金生物有限公司；限制性內(nèi)切酶均購(gòu)自Fermentas公司；T4 DNA連接酶購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；質(zhì)粒小提試劑盒和膠回收試劑盒購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；農(nóng)桿菌菌株EHA105以及RNAi載體pF-GC5941為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2DNA和氨基酸序列分析、DNA合成

DNA測(cè)序和DNA合成均由上海桑尼生物科技有限公司完成。基因開放閱讀框（ORF）由ORF Finder（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gorf/）獲得。氨基酸序列比對(duì)由DNAMAN序列分析軟件（LynnonBiosoft）完成。

1.3農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化

2014年7月在萊西試驗(yàn)站專門的轉(zhuǎn)基因試驗(yàn)區(qū)按本項(xiàng)目組專利技術(shù)（專利號(hào)：ZL2011 10058531.2）對(duì)粵油20進(jìn)行農(nóng)桿菌注射。10月收獲種子，晾干，保存。

1.4轉(zhuǎn)基因花生的PCR檢測(cè)

在花生種子遠(yuǎn)離胚芽的一端切下薄薄的一層子葉組織，利用該部分組織提取DNA，提取方法參照國(guó)家發(fā)明專利“花生健康組織和病組織簡(jiǎn)便快速DNA提取方法”（專利號(hào)：ZL 2009 10255786.0）。經(jīng)上述處理的花生種子可以進(jìn)行正常種植。用基因特異引物（見表1）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，篩選PCR陽(yáng)性花生種子。PCR程序如下：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。

2結(jié)果與分析

2.1黃曲霉漆酶基因片段的獲得

在NCBI上搜索到兩個(gè)可能的漆酶基因（XM_002373291和XM_002382249），長(zhǎng)度分別為1764bp和1797bp，分別標(biāo)記為L(zhǎng)ac1和Lac2。經(jīng)NCBI Blast分析，發(fā)現(xiàn)兩者都具有3個(gè)保守的銅原子結(jié)合位點(diǎn)。將Lac1和Lac2編碼的氨基酸與GenBank中登錄的蛋白序列進(jìn)行比對(duì)后發(fā)現(xiàn)：這兩個(gè)基因與其它真菌漆酶基因編碼的氨基酸序列具有較高的同源性（圖1）。

分別選取Lac1（139-448）和Lac2（20-329）各310bp的序列（圖2），每個(gè)片段的5′端添加限制性內(nèi)切酶Xba I-Asc I識(shí)別序列，3′端添加Swa I-BamH I識(shí)別序列，以方便構(gòu)建RNAi載體。由上海桑尼生物科技有限公司進(jìn)行全基因合成。片段合成后，亞克隆到克隆載體pUC57中，得到的載體分別命名為pUC57-Lac1和pUC57-Lac2。經(jīng)M13F引物測(cè)序，序列完全正確。endprint

2.2黃曲霉漆酶基因RNAi載體的構(gòu)建

用限制性內(nèi)切酶Asc I和Swa I將Lac1和Lac2片段分別從pUC57-Lac1（圖3B，以Lac1為例，下同）和pUC57-Lac2切下，連接到同樣經(jīng)過Asc I和Swa I酶切的植物RNAi載體pFGC5941（圖3A，載體信息見http：//www.snapgene.com/resources/plasmid_files/plant_vectors/pFGC5941/）。經(jīng)特異引物（見表1）篩選，得到含目的片段的質(zhì)粒pF-GC5941-Lac1-1（圖4A）和pFGC5941-Lac2-1。

質(zhì)粒pUC57-Lac1和pUC57-Lac2經(jīng)BamH I和Xba I酶切（圖3D），得到的片段連接到經(jīng)BamH I和Xba I酶切的pFGC5941-Lac1-1（圖3C）和pFGC5941-Lac2-1中，經(jīng)PCR篩選，得到帶有第二個(gè)片段的質(zhì)粒pFGC5941-Lac1-2（圖4B）和pFGC5941-Lac2-2。此時(shí)，載體中均包含一個(gè)正向目的片段和反向目的片段及中間由ChsA intron間隔的結(jié)構(gòu)。

2.3轉(zhuǎn)基因花生T₀代種子的PCR檢測(cè)

將構(gòu)建好的質(zhì)粒pFGC5941-Lac1-2轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌菌株EHA105中，利用本課題組發(fā)明的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法對(duì)易感黃曲霉品種粵油20進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，收獲了轉(zhuǎn)Lac1基因的花生種子29粒；提取DNA后，利用Lac1特異引物（見表1）進(jìn)行PCR篩選。結(jié)果篩選到轉(zhuǎn)Lac1的PCR陽(yáng)性花生種子11粒，轉(zhuǎn)化率達(dá)38%。圖5僅顯示部分結(jié)果，其中2～5號(hào)和7號(hào)樣品有目的條帶，N為陰性對(duì)照，P為陽(yáng)性對(duì)照。目前，這些PCR陽(yáng)性花生種子已種于轉(zhuǎn)基因隔離區(qū)，所結(jié)種子將用于黃曲霉抗性鑒定。

3討論與結(jié)論

國(guó)內(nèi)外長(zhǎng)期以來(lái)通過常規(guī)手段培育抗黃曲霉花生品種，周期長(zhǎng)、進(jìn)展緩慢且效果不甚理想。基因工程技術(shù)有望解決花生黃曲霉毒素污染問題。寄主誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因沉默（HIGS）技術(shù)是一種研究病原物（真菌等）基因功能以及控制病原物造成其寄主病害的全新技術(shù)。該技術(shù)將構(gòu)建的含病原物目的基因片段發(fā)夾結(jié)構(gòu)的載體轉(zhuǎn)化到寄主中，從而導(dǎo)致病原物特定基因序列雙鏈RNA（dsRNA）表達(dá)；當(dāng)病原物侵染表達(dá)了dsRNA的寄主時(shí)，dsRNA由寄主傳遞給病原物，對(duì)病原菌內(nèi)源特定基因的表達(dá)進(jìn)行RNA干擾，從而引起病原菌特定基因表達(dá)的下調(diào)。該技術(shù)為花生抗黃曲霉育種提供了新思路，但目前尚未見有利用HIGS技術(shù)增強(qiáng)花生對(duì)黃曲霉抗性的研究報(bào)道。

黃曲霉漆酶活性高低被認(rèn)為與黃曲霉致病性強(qiáng)弱有直接關(guān)系。為了抑制黃曲霉漆酶基因Lac1和Lac2的表達(dá)，本研究以黃曲霉兩個(gè)漆酶基因?yàn)镠IGS的靶標(biāo)，構(gòu)建其RNAi載體，并對(duì)感黃曲霉花生品種粵油20進(jìn)行農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化，初步獲得了轉(zhuǎn)Lac1的PCR陽(yáng)性花生種子。從圖5中可以看出，PCR陽(yáng)性樣品目的條帶較弱，可能與提取的DNA質(zhì)量較差有關(guān)。花生種子中油分含量較高，DNA較難提取，其提取質(zhì)量與操作者的不熟練程度密切相關(guān)。

為進(jìn)一步研究轉(zhuǎn)黃曲霉漆酶基因的花生是否抗黃曲霉，本課題組已將PCR陽(yáng)性轉(zhuǎn)Lac1花生推斷轉(zhuǎn)化體種子種植于轉(zhuǎn)基因試驗(yàn)區(qū)，待收獲種子后將進(jìn)行黃曲霉侵染鑒定，檢測(cè)其是否獲得了黃曲霉抗性。同時(shí)，將繼續(xù)用含Lac2的RNAi載體對(duì)粵油20進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，以期獲得抑制Lac2表達(dá)的轉(zhuǎn)基因花生。

本研究為利用HIGS技術(shù)探討黃曲霉漆酶基因與黃曲霉致病性的關(guān)系奠定了基礎(chǔ)，為培育抗黃曲霉花生新品種提供了一條新的思路。endprint