甜瓜CBL基因的鑒定和特征分析

劉明毓　紀(jì)復(fù)勤　馬強(qiáng)　胡向樹　李利斌　董玉梅

摘要：CBL基因在植物逆境應(yīng)答和生長(zhǎng)發(fā)育中具有重要功能，但有關(guān)甜瓜CBL基因的研究尚未見報(bào)道。本文利用比較基因組學(xué)的方法，從甜瓜基因組中鑒定出7個(gè)CBL基因，并對(duì)其基因組分布、基因結(jié)構(gòu)、系統(tǒng)進(jìn)化和順式調(diào)控元件進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示，7個(gè)甜瓜CBL基因分布在不同的染色體上，均含有8個(gè)外顯子，編碼區(qū)在642～738bp，編碼的蛋白均含有3個(gè)結(jié)合鈣離子的EF手結(jié)構(gòu)和能夠與CIPK互作的FPSF位點(diǎn)。而且，在它們的上游基因序列中存在多個(gè)環(huán)境應(yīng)答元件，且各不相同，暗示它們可能具有多種生物學(xué)功能。本文為進(jìn)一步研究甜瓜CBL基因的功能奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：甜瓜；CBL；結(jié)構(gòu)；進(jìn)化；順式元件

中圖分類號(hào)：S652.01

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A

文章編號(hào)：1001-4942（2015）10-0017-05

植物中一類與鈣結(jié)合的CBL蛋白（類鈣調(diào)磷酸酶B亞基蛋白，Calcineurin-B like protein）能夠感受鈣信號(hào)，在植物非生物逆境應(yīng)答、礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)吸收和ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中具有重要功能。CBL主要是通過(guò)和一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（CIPK）互作來(lái)調(diào)控下游基因的表達(dá)，以響應(yīng)各種不同的逆境信號(hào)，這一信號(hào)系統(tǒng)在植物界廣泛存在。目前有關(guān)植物CBL的研究日益受到關(guān)注，從模式植物擬南芥和水稻不斷向其他作物擴(kuò)展，其中以擬南芥CBL的研究最為深入。擬南芥CBL1和CBL9可以與CIPK23結(jié)合，調(diào)控下游基因AKT1的表達(dá)，從而促進(jìn)鉀離子的吸收；CBL1還參與了ABA的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、冷脅迫應(yīng)答過(guò)程以及植物對(duì)葡萄糖和赤霉素的響應(yīng)；CBL2和CBL3能夠調(diào)控植物生長(zhǎng)、種子大小和胚胎發(fā)育；CBLA/SOS3和CBL10蛋白可以和CIPK24（SOS2）結(jié)合，調(diào)控下游基因SOS1（鈉離子/質(zhì)子-反向運(yùn)輸載體）的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞中鈉離子的排出，從而提高植物對(duì)鹽脅迫的抗性；擬南芥CBL5過(guò)表達(dá)可以提高植物的抗旱能力；CBL9還可調(diào)控ABA的合成及應(yīng)答反應(yīng)。最近報(bào)道擬南芥的CBL2和CBL3在高鎂脅迫應(yīng)答中具有重要功能。

甜瓜作為重要的園藝作物，其非生物逆境抗性對(duì)于生產(chǎn)具有重要意義。但有關(guān)甜瓜CBL基因的研究尚未見報(bào)道。本文利用比較基因組學(xué)的方法從甜瓜基因組中鑒定出7個(gè)CBL基因，并對(duì)其染色體分布、分子特征、遺傳進(jìn)化及順式調(diào)控元件進(jìn)行了分析，為進(jìn)一步研究它們?cè)谔鸸夏婢硲?yīng)答中的功能奠定了基礎(chǔ)。

1研究方法

利用擬南芥的CBL基因序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）搜索比對(duì)甜瓜的基因組序列，尋找甜瓜的CBL基因序列，對(duì)鑒定出的CBL基因進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析和遺傳進(jìn)化分析，并對(duì)啟動(dòng)子序列中的順式元件進(jìn)行預(yù)測(cè)。結(jié)構(gòu)分析利用GSDS（http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/）在線進(jìn)行，遺傳進(jìn)化分析利用MEGA4.1進(jìn)行，采用Bootstrap test-Neighbor Joining方法，重復(fù)1000次運(yùn)算。蛋白序列比對(duì)采用DNAMAN方法，順式元件預(yù)測(cè)采用PlantCARE軟件進(jìn)行在線分析。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)在WoLF PSORT（http：//wolfpsort.org/）中進(jìn)行。蛋白基序分析用Motif Scan（http：//myhits.isb-sib.ch/cgi-bin/motif_scan）在線進(jìn)行。

2結(jié)果與分析

2.1甜瓜CBL基因的鑒定和特征分析

筆者從甜瓜基因組中鑒定出7個(gè)CBL基因（表1），分別命名為CmCBL1～CmCBL7。它們?cè)诨蚪M中的分布是不均勻的，其中，CmCBL1位于3號(hào)染色體，CmCBL2位于4號(hào)染色體，CmCBL7位于8號(hào)染色體，其余4個(gè)基因均位于6號(hào)染色體。結(jié)構(gòu)分析顯示，它們都含有8個(gè)外顯子。編碼區(qū)序列大小是600～750bp，差異不大，但是基因組序列大小差異明顯（圖1）。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)顯示，它們編碼的蛋白分別定位在細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核或者葉綠體中。

2.2甜瓜CBL基因的系統(tǒng)進(jìn)化和蛋白結(jié)構(gòu)分析

基因的遺傳進(jìn)化分析可為基因功能研究提供重要的線索。分析結(jié)果顯示，甜瓜的CBL基因分為三類（圖2）：CmCBL2/3/4/6為一類；CmCBL1單獨(dú)為一類；而CmCBL5/7為第三類。CmCBL1與AtCBL10直系同源，CmCBL2與AtCBL1直系同源；CmCBL3與AtCBL5直系同源；CmCBL4與AtCBL4直系同源；CmCBL5/7與AtCBL2/3直系同源；CmCBL6與AtCBL9直系同源。序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，甜瓜CBL蛋白含有多個(gè)保守的氨基酸殘基和位點(diǎn)（圖3），其中包括能與蛋白激酶CIPK互作的位點(diǎn)FPSF。蛋白基序分析發(fā)現(xiàn)，它們都含有3個(gè)EF手結(jié)構(gòu)，1～2個(gè)磷酸化位點(diǎn)；多數(shù)還含有糖基化位點(diǎn)和豆蔻?；稽c(diǎn)（表2）。只有CmCBL2含有一個(gè)酰胺化位點(diǎn)。從結(jié)構(gòu)上看，它們能與鈣離子結(jié)合，且能與CIPK互作。

2.3甜瓜CBL基因的順式調(diào)控元件分析

順式調(diào)控元件在基因表達(dá)調(diào)控中具有重要功能。分析發(fā)現(xiàn)，在甜瓜CBL基因的上游序列中存在多個(gè)逆境和激素應(yīng)答元件，且在種類和數(shù)目上各不相同（表3）。其中，CmCBL2/4/6/7含有脫落酸應(yīng)答元件ABRE，CmCBL2/3/4/5/6具有真菌激發(fā)子應(yīng)答元件Box-W1；CmCBL3/6/7具有茉莉酸甲酯應(yīng)答元件CGTCA-motif；它們都含有赤霉素應(yīng)答元件GARE-motif或者p-box；Cm-CBL1/2/3/6/7有熱脅迫應(yīng)答元件HSE；CmCBL4還有一個(gè)冷脅迫應(yīng)答元件LTR；CmCBL3/4/6有干旱誘導(dǎo)元件MBS；除CmCBL4外，還都有逆境和防衛(wèi)應(yīng)答元件TC-rich repeats；CmCBL2/3/4/5/6都有水楊酸應(yīng)答元件；CmCBL2/3/4/6有防衛(wèi)應(yīng)答元件。

3結(jié)論與討論

本文從全基因組水平對(duì)甜瓜CBL基因進(jìn)行分析，結(jié)果顯示甜瓜基因組中存在7個(gè)CBL基因，分別位于不同的染色體上。它們?cè)谶M(jìn)化上分為3個(gè)不同的類群，在外顯子數(shù)目上保守，均為8個(gè)。它們編碼的蛋白都具有EF手結(jié)構(gòu)、與蛋白激酶CIPK的互作位點(diǎn)FPSF和多個(gè)保守的氨基酸殘基，可能這些位點(diǎn)為其行使功能所必須。在它們的上游序列中，都存在多個(gè)激素和逆境應(yīng)答元件，且各不相同。它們可能不僅應(yīng)答非生物逆境，而且也可應(yīng)答生物逆境。在水稻和番茄中最近研究的成果也間接證實(shí)了這一點(diǎn)。根據(jù)系統(tǒng)進(jìn)化和順式調(diào)控元件分析的結(jié)果以及擬南芥CBL研究的進(jìn)展，筆者認(rèn)為甜瓜CBL基因具有多樣的生物學(xué)功能：CmCBL1可響應(yīng)赤霉素信號(hào)和熱脅迫、鹽脅迫及生物逆境；CmCBL2可響應(yīng)ABA、赤霉素和水楊酸信號(hào)以及參與植物防衛(wèi)應(yīng)答反應(yīng)；CmCBL3參與干旱、熱以及病原物脅迫應(yīng)答；CmCBL4參與ABA信號(hào)及鹽、冷、干旱等脅迫應(yīng)答；CmCBL5/7參與種子發(fā)育和鹽脅迫應(yīng)答；CmCBL6參與鉀離子吸收和ABA等信號(hào)應(yīng)答。本文為進(jìn)一步研究甜瓜CBL的功能奠定了基礎(chǔ)。endprint