藕的組織切片制作方法及顯微結構研究

徐國鑫　李效尊　劉蓬　尹靜靜　吳修

摘要：通過組織切片制片和染色方法改進，建立了能夠清晰顯示藕的組織和細胞結構的技術體系，并在此基礎上分析了淀粉粒、維管束和分泌細胞的分布規律。

關鍵詞：藕；組織切片；顯微結構

中圖分類號：S645.101

文獻標識號：A

文章編號：1001-4942（2015）10-0029-04

蓮是睡蓮科多年生水生草本植物，藕是其膨大的根狀莖，藕營養成分豐富，是我國優良的特色蔬菜和副食佳品。藕的地方品種數量繁多，品質各有特色。隨著我國人民生活水平的改善，消費者對藕品質的要求日益提高，其品質性狀成為蓮藕育種和食品領域專家關注的重點。

以往對于藕品質的研究，主要從測定其所含糖類、淀粉、纖維素等成分入手，而針對其細胞形態和內含物質分布規律的研究比較缺乏。石蠟切片技術被廣泛應用于植物組織結構研究，但是對于不同特性的植物樣品，需要對制片和染色方法進行改進。目前尚未見藕石蠟切片制作技術相關研究的報道。

本實驗室前期研究發現，蓮藕細胞內含有大量淀粉粒，使用蕃紅、固綠和甲苯胺藍等傳統染色方法對藕的石蠟切片進行染色，效果不夠理想。為此筆者經過多次試驗探索出PAS反應-甲苯胺藍雙重染色的方法，它能清晰顯示出藕的細胞壁、維管束和淀粉粒等結構，從而可增進對蓮藕組織結構的了解，也為進一步研究其發育過程和貯藏物質積累規律提供必要技術手段。

1材料與方法

1.1試驗材料

蓮藕雜交品系由山東省農業科學院水生生物研究中心培育，種植于該院飲馬泉試驗基地。2014年12月設三個取樣點挖取其膨大的地下莖，選其節段中部為供試材料。

1.2試驗方法

1.2.1所需試劑 ①FAA固定液：50%乙醇：福爾馬林：冰醋酸=90：5：5。②席夫（Sehiff）試劑：稱取堿性品紅0.5g，加入蒸餾水100mL，沸水浴加熱溶解5min，冷卻至室溫后經濾紙過濾，加入偏亞硫酸氫鈉1g和濃鹽酸2mL，充分混勻后避光密封保存，約24h后試劑變成淺黃色即可使用。③改良甲苯胺藍染色液：稱取甲苯胺藍0.5g，加入30%乙醇100mL，加熱至65℃，攪拌30min，過濾后避光保存。

1.2.2制片 石蠟切片方法參照田晨霞等的方法并進行改進，具體步驟為：

①固定：將蓮藕莖段中部切成厚度2mm的薄片，浸入FAA固定液中，用真空泵抽氣20min，固定12h以上。

②脫水：依次通過質量分數為50%、75%、95%、100%梯度乙醇溶液，100%乙醇溶液需更換3次，每次2h。依次通過體積比為50%、75%、100%梯度乙醇/二甲苯溶液，100%二甲苯溶液需更換3次，每次2h。

③浸蠟：將樣品浸入50%石蠟/二甲苯溶液中，置于60℃烘箱，6h后將50%石蠟/二甲苯溶液吸出，換全蠟3次，每次6h。將樣品倒入包埋模具中，冷卻至室溫。

④切片：在轉輪式切片機上切成厚度為10μm切片，置于載玻片上，40℃展片；載玻片上的水分徹底蒸發后，用二甲苯脫蠟、無水乙醇浸洗。

⑤復水：依次通過質量分數為100%、95%、75%、50%和30%梯度乙醇溶液。

1.2.3染色 以傳統的甲苯胺藍染色法作為對照，使用PAS-甲苯胺藍染色法對藕石蠟切片進行染色，具體步驟如下：

①PAS染色：參考Bronner的方法，并進行改進。將粘附有切片的載玻片浸入0.4%（W/W）的高碘酸鉀溶液中處理20min，自來水沖洗，蒸餾水浸洗3次，每次2min；浸入Sehiff試劑中染色20min，自來水沖洗，蒸餾水浸洗2次，每次1min。

②甲苯胺藍染色：將載玻片浸入改良甲苯胺藍染色液中，染色10min，自來水沖洗，蒸餾水浸洗2次，每次1min，35℃烘干。中性樹膠封片，鏡檢拍照。

2結果與分析

2.1染色效果比較

在顯微鏡下觀察傳統甲苯胺藍染色法染色后的藕石蠟切片（圖1），可以看到，甲苯胺藍對不同成分的著色特異性較差，只能將淀粉粒和薄壁細胞染為淡藍色（圖1A），并且對表皮細胞著色過深（圖1B），無法看清細胞內含物質情況。

使用PAS-甲苯胺藍雙重染色法獲得的切片，細胞形態飽滿，細胞壁被染為藍色，細胞內的淀粉粒被染為紫紅色，維管束、氣腔和分泌細胞等結構清晰（圖2B）。本方法不但能夠區分不同組織和結構的分布情況，而且染色效果穩定，經封片后可以保存數月而不褪色。

2.2藕組織結構觀察

以最外層的細胞為第1層細胞，依次向內統計細胞層數。藕的表皮共有2層細胞構成，其細胞壁較厚，細胞內不含淀粉粒；其中第1層細胞的內含物較少，第2層細胞被黑褐色物質充滿，可能是由酚類物質在制片過程中受到氧化形成的（圖2B）。從第3層細胞開始呈現薄壁細胞形態，細胞體積和內部淀粉粒的體積逐層增大（圖3、圖4），至第6層細胞之后，細胞呈相間排列，分層不明顯。薄壁細胞之間散在分布有維管束，靠近表皮的維管束較細（圖2C）；靠近內側的維管束較粗，有2～3層維管束鞘細胞包圍，內部含有氣腔（圖2D）。

此外，在薄壁細胞之間分布有少量的分泌細胞（圖2B、圖2D），分泌細胞內部的物質在切片制作過程中氧化成黑褐色的顆粒，推測這些物質中含有較多的酚類，可能與藕食品加工過程中的褐化現象有關。

3討論與結論

本研究改進組織切片染色方法后，能清晰顯示出藕的組織和細胞結構。傳統的石蠟切片染色方法，使用蕃紅、固綠和蘇木精等染料，若染色條件控制不當會導致染色不足和染色過度。本研究改為雙重染色法，首先使用PAS反應將淀粉染成鮮紅色，再用甲苯胺藍將細胞壁染為藍色（淀粉粒也輕微著色而變成紫紅色），染色效果清晰穩定（圖2）。

淀粉的含量和性質與藕的品質密切相關。本試驗建立的組織制片技術體系能夠清晰地顯示淀粉粒的分布，對研究蓮藕淀粉的積累規律和評價蓮藕種質資源均有重要意義。本試驗發現藕表皮細胞和分泌細胞中含有的物質氧化后變為黑褐色，這些物質可能與藕烹飪過程中的褐化現象有關，需要進一步探明褐化物質的成分和積累規律。本研究成果為在細胞生物學水平上研究蓮藕品質性狀奠定了基礎，我們將結合其它技術手段解析影響蓮藕品質的構成因素，推動蓮藕品質育種進步。endprint