米非司酮調控BRCA1、BRCA2蛋白表達的研究

蘇晨，趙愛華，張瑤楠，丁寧，郭永＊，王乾興

（1.遵義醫學院細胞生物學與遺傳學教研室，遵義 563000；2.國家衛生計生委男性生殖健康重點實驗室，國家衛生計生委科學技術研究所，北京 100081；3.解放軍第309醫院婦產科，北京 100091）

全球乳腺癌發病率自20 世紀70 年代末開始一直呈上升趨勢，作為嚴重威脅女性生命安全的主要疾病之一，乳腺癌的病因尚未完全清楚，醫生會根據腫瘤的分期和患者的身體狀況，酌情采用手術、放療、化療、內分泌治療、生物靶向治療及中醫藥輔助治療等多種手段，其中約2／3 的治療是激素治療［1］。米非司酮作為一種強抗孕激素類物，同時，米非司酮還具有增強抗癌藥物療效、抑制腫瘤細胞增殖等其它一些新的功能，可用于乳腺癌的內分泌治療［2］。米非司酮在孕激素受體陰性的乳腺癌中表現出抗癌作用，但其作用機制尚未明確，可見米非司酮的作用機制尤為復雜，米非司酮可以在不同條件下通過不同的作用機制來發揮抗腫瘤作用。BRCA 腫瘤抑制基因（BRCA tumor suppressor）是乳腺癌／卵巢癌特異性的腫瘤抑制基因［3］。本研究旨在通過研究不同濃度米非司酮對乳腺癌細胞處理后中BRCA1、BRCA2蛋白的表達變化，進一步明確米非司酮的作用機制，為米非司酮乳腺癌內分泌治療中相應治療機制的闡明提供科學的實驗依據。

材料與方法

一、材料與試劑

1.細胞系：乳腺癌細胞系MCF7購自于中國醫學科學院基礎醫學研究所基礎醫學細胞中心。用含10%胎牛血清（FBS）的DMEM 培養基，37℃、5%CO2、飽和濕度的細胞培養箱中培養。

2.主要試劑：米非司酮（Sigma，美國），DMEM培養基、RPMI 1640培養基、FBS、0.25%胰蛋白酶（GIBCO，美 國），小 鼠 抗 人BRCA1 單 克 隆 抗 體（Calbiochem，德國），兔抗人BRCA2 多克隆抗體（Santa，美國），兩步法抗小鼠二抗檢測試劑盒、兩步法抗兔二抗檢測試劑盒、DAB 顯色試劑盒（北京中杉金橋）。

二、實驗方法

1.細胞處理方法及實驗分組：根據本實驗室前期研究［4］，分別用濃度為0.25、2.5、25和50μmol／L米非司酮處理人乳腺癌細胞系MCF-7 細胞，處理1d后分別收集不同處理組細胞。根據米非司酮的濃度分為：對照組（以空白溶劑代替米非司酮）、0.25μmol／L組、2.5μmol／L 組、25μmol／L 組 和50μmol／L組。

2.細胞爬片制備：將0.8cm×0.8cm 干凈玻璃片置于培養瓶底部，待細胞貼壁生長于玻璃片后，取出玻璃片浸泡于丙酮︰甲醇（1︰1）固定液中，4℃固定15min，取出玻璃片，自然晾干，用中性樹膠貼附于載玻片上，進行免疫組化實驗。

3.細胞免疫組織化學法：將細胞爬片置PBS緩沖液中浸洗5min后，置于1% Triton X-100，室溫處理15min；PBS浸洗3次，5min／次，3% H2O2室溫孵育15 min；PBS 浸洗，分別滴加BRCA1 和BRCA2一抗稀釋液（抗BRCA1稀釋為1∶100，抗BRCA2為1∶150），4℃過夜。PBS浸洗，滴加兩步法二抗工作液，37℃孵育30min；PBS浸洗，DAB顯色劑顯色，顯微鏡下控制顯色情況；自來水充分沖洗，蘇木素復染15min；梯度酒精脫水透明，中性樹膠封片。PBS代替一抗為陰性對照。

4.平均光密度值半定量分析：在顯微鏡下，分別隨機選取各組5 個視野拍照，用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件（Media Cybernetics，美國）對各組照片進行平均光密度值半定量分析，樣本數值為5個視野光密度值的平均值。

5.BRCA1、BRCA2蛋白細胞核內陽性表達率計算：由兩人分別對各組的5個視野進行全細胞計數以及細胞核表達陽性細胞計數，細胞核內表達率＝細胞核陽性細胞數／細胞總數，各組數值為各視野細胞核內表達率平均值。

三、統計學方法

采用SPSS 13.0軟件進行數據的處理和統計分析，計量資料采用（±s）表示，均數間多重比較采用Fisher LSD 檢驗，多組間比較采用One-way ANONA，P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、比較不同濃度米非司酮處理的MCF7細胞中BRCA1蛋白表達

免疫組織化學結果顯示：對照組和米非司酮處理各組均呈BRCA1蛋白陽性表達（圖1）。與米非司酮處理各組相比較，對照組細胞中BRCA1蛋白表達較弱，且呈細胞胞漿陽性（圖1A）；米非司酮0.25μmol／L組細胞BRCA1蛋白主要表達于胞漿，少量細胞呈核陽性（圖1B）；米非司酮2.5μmol／L組細胞BRCA1蛋白陽性強于其他各組，其細胞核和細胞漿均為陽性（圖1C）；陰性對照組未有陽性表達（圖1F）。

采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件（Media Cybernetics）進行各組圖像平均光密度值分析，結果顯示：與其他各組相比較，2.5μmol／L 組BRCA1蛋白表達量最高，顯著高于其他各組（P 均＜0.05）；25μmol／L 組BRCA1 蛋 白 表 達 量 高 于 對 照 組、0.25μmol／L組和50μmol／L 組，差異有統計學意義（P 均＜0.05）；對 照 組、0.25 μmol／L 組 和50μmol／L組各組之間差異無統計學意義（P ＞0.05）（圖2）。

二、比較不同米非司酮處理的MCF7 細胞中BRCA2蛋白表達

結果顯示：BRCA2蛋白在對照組和米非司酮處理各組均有表達（圖3）。對照組細胞中，BRCA2蛋白主要表達于細胞胞漿中（圖3A）；米非司酮各組BRCA2蛋白陽性較強，細胞胞漿和細胞核中均有表達（圖3B、C、D 和E）陰性對照組未有陽性表達（圖3F）。

各組圖像平均光密度值比較發現：米非司酮處理各組平均光密度值均高于對照組，差異具有統計學意義（P 均＜0.05）；2.5μmol／L 組平均光密度值最高，顯著高于0.25μmol／L 組、25μmol／L 組和50μmol／L組（P＜0.05）（圖4）。

三、不同濃度米非司酮組細胞核BRCA1、BRCA2蛋白陽性表達率

對照組細胞核中BRCA1和BRCA2 蛋白陽性表 達 率［（分 別 為（19.58±6.90）% 和（36.60±3.01）%）］均較低，顯著低于米非司酮其他各組（P 均＜0.05）；2.5μmol／L組和25μmol／L組細胞核中BRCA1蛋白陽性表達率顯著高于0.25μmol／L組和50μmol／L 組，差 異 有 統 計 學 意 義（P 均＜0.05）；米非司酮處理各組細胞核BRCA2蛋白陽性率之間差異無統計學意義（P＞0.05）。

討 論

乳腺癌易感基因1（BRCA1）和乳腺癌易感基因2（BRCA2）是乳腺癌發生有關的兩個易感基因，乳腺癌的發生、發展和轉移與這兩種基因的異常表達密切相關。BRCA1 是1990 年首次發現并定位于17號染色體的長臂的多功能區核蛋白，基因結構全長約81KB，包含24個外顯 子，其中22個編碼［5］；BRCA2是1994 年由Wooster等［6］定位于13q12-13，基因結構全長約60kb，由10 254 個核苷酸組成，含21 個外顯子。抑癌基因BRCA 表達的蛋白具有重要的生物學功能，包括細胞周期調控、DNA損傷修復、基因的轉錄調節、細胞凋亡和泛素化等，尤以兩者在DNA 損傷修復、同源重組和轉錄調控中的功能最為顯著和重要。

圖1 不同濃度米非司酮對人乳腺癌細胞系MCF-7細胞的BRCA1蛋白的表達影響。免疫組化法×200

圖2 不同濃度米非司酮對人乳腺癌細胞系MCF-7細胞的BRCA1蛋白表達定量分析結果

目前臨床上已經將米非司酮廣泛用于抗腫瘤的治療，也已經進入臨床試驗階段。目前關于米非司酮抗腫瘤作用的可能機制主要有：促進腫瘤細胞凋亡［7］、抑制腫瘤細 胞的增殖［8］、調節細胞 周期［9］、調節細胞因子或受體［10］、逆轉腫瘤細胞耐藥性［11］等。1987年，Bardon等［12］發現米非司酮具有抗乳腺癌細胞增殖作用。業已證實，米非司酮對人類乳腺癌細胞有劑量依賴性的生長抑制作用，而且這種作用與細胞中孕酮受體呈明顯正相關，作用機制可能與其各自的孕酮受體容量有關。另外還發現，對于絕經前婦女，米非司酮（連續3個月隔天給予50mg劑量）能夠抑制乳腺癌細胞的增殖，對于乳腺上皮細胞具有一定的保護作用［13］。

3 不同濃度米非司酮對人乳腺癌細胞系MCF-7細胞的BRCA2蛋白表達影響。免疫組化法×200

圖4 不同濃度米非司酮對人乳腺癌細胞系MCF-7細胞的BRCA2蛋白表達定量分析結果

表1 不同濃度米非司酮組細胞核BRCA1、BRCA2蛋白陽性率比較［（±s）%］

表1 不同濃度米非司酮組細胞核BRCA1、BRCA2蛋白陽性率比較［（±s）%］

注：與米非司酮各組比較，＊P 均＜0.05；分別與50 μmol／L組比較，＃P＜0.05

組 別 BRCA1蛋白陽性率 BRCA2蛋白陽性率對照組 19.58±6.90＊ 36.60±3.01＊0.25μmol／L 50.32±8.83 93.65±2.45 2.5μmol／L 95.92±0.27＃ 95.79±0.86 25μmol／L 93.26±3.37＃ 97.40±0.97 50μmol／L 63.49±34.14 85.69±23.61

我們前期結果顯示，米非司酮抑制乳腺癌細胞系MCF-7和T47D 細胞增殖、促進細胞凋亡。2006年，Poole等［14］在Science雜志上發表了他們研究小組的重要結果：BRCA1／p53 基因敲除小鼠中米非司酮可以抑制乳腺癌的生長。有研究表明，在乳腺癌細胞中，BRCA1基因的表達受激素的調控（雌激素和孕激素）［15］，而米非司酮作為孕激素受體的拮抗劑極有可能通過調控BRCA1或BRCA2在乳腺癌中發揮作用。我們前期研究證實，米非司酮確實在轉錄水平上調控BRCA1 和BRCA2 基因的表達［16］。而本研究發現，米非司酮也在蛋白水平上上調乳腺癌細胞系MCF7細胞中BRCA1、BRCA2的表達。與對照組比較，不同濃度米非司酮處理后，MCF7細胞中BRCA1 和BRCA2蛋白的表達量均增加，2.5μmol／L 組BRCA1和BRCA2蛋白表達量最高，但隨著米非司酮濃度增加，BRCA1 和BRCA2蛋白的表達量有所降低，可能是不同濃度米非司酮促蛋白表達模式不同。

BRCA1和BRCA2 腫瘤抑制基因的主要功能是參與細胞分裂S 期和細胞DNA 損傷后的DNA修復，BRCA 突變細胞缺乏染色體雙鏈DNA 缺口的修復能力，導致染色體不穩定。在突變攜帶人群中，由于不能有效地進行DNA 雙鏈缺口修復，從而導致早期乳腺癌和卵巢癌的發生［17］。本研究顯示，米非司酮處理后，BRCA1和BRCA2蛋白表達有空間定位變化，對照組細胞中BRCA1蛋白呈細胞胞漿陽性；米非司酮0.25μmol／L 組則主要表達于胞漿，少量細胞呈核陽性；米非司酮2.5μmol／L 組細胞核和細胞漿均為陽性。對照組細胞中，BRCA2蛋白主要表達于細胞胞漿中；米非司酮各組細胞胞漿和細胞核中均有表達。通過比較各組的細胞核內陽性表達率發現，對照組細胞核中BRCA1和BRCA2蛋白陽性表達率分別為（19.58±6.90）%和（36.60±3.01）%，均呈較低狀態，且顯著低于米非司酮各個組（P 均＜0.05）；米非司酮2.5μmol／L組和25μmol／L組細胞核中BRCA1 蛋白陽性表達率顯著高于0.25μmol／L組和50μmol／L組，差異有統計學意義（P 均＜0.05）。即米非司酮可以促進MCF7細胞中BRCA1、BRCA2蛋白的入核表達，有利于BRCA1和BRCA2基因發揮DNA修復、同源重組和轉錄調控等功能，但米非司酮調控的具體作用機制及其生物學功能還需要進一步深入展開研究。

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