組織因子途徑抑制物－2在宮頸癌中的表達及其對宮頸癌細胞增殖、凋亡的影響

組織因子途徑抑制物-2在宮頸癌中的表達及其對宮頸癌細胞增殖、凋亡的影響

孟斐

(沈陽醫學院附屬中心醫院婦產科，遼寧沈陽110024)

摘要〔〕目的觀察組織因子途徑抑制物(TFPI)-2在正常宮頸、宮頸上皮內腫瘤(CIN)和宮頸鱗癌組織中表達的差異及TFPI-2對體外培養的宮頸癌Hela細胞增殖和凋亡的影響。方法收集2009～2010年在該院婦產科住院治療的68例宮頸鱗癌患者，48例CIN患者及12例宮頸正常患者的宮頸組織標本，免疫組化染色檢測宮頸組織中TFPI-2的表達。取生長狀態良好的宮頸癌Hela細胞，應用基因轉染的方法建立TFPI-2高表達細胞系，Real-time PCR和Western印跡方法檢測基因轉染前后細胞中TFPI-2 mRNA和蛋白的表達；四甲基偶氮唑藍比色法(MTT)檢測各組細胞的增殖活性，流式細胞儀檢測細胞凋亡。結果①免疫組化染色顯示，正常宮頸組織、CIN和宮頸癌中TFPI-2表達逐漸降低，三者間比較差異有統計學意義 (P<0.01)。②體外觀察發現，轉染pcDNA3.1-TFPI-2的Hela-TFPI-2組細胞TFPI-2 mRNA和蛋白表達明顯高于轉染空白質粒組和空白對照組(P<0.01)；MTT結果顯示，Hela-TFPI-2組細胞增殖速度明顯低于空白對照組和空白質粒組，且隨著培養時間的延長，這種抑制作用更明顯(P<0.05)；流式細胞儀檢測結果顯示Hela-TFPI-2組細胞凋亡率顯著高于空白對照組和空白質粒組(P<0.05)。結論TFPI-2表達隨著宮頸病變的進展逐漸降低；同時過表達的TFPI-2可明顯抑制宮頸癌Hela細胞增殖，促進其凋亡。提示TFPI-2的表達減少可能是宮頸癌發生發展的機制之一，TFPI-2可能是治療宮頸癌的新靶點。

關鍵詞〔〕宮頸癌；組織因子途徑抑制物-2；Hela細胞；細胞增殖；凋亡

中圖分類號〔〕R73〔

第一作者：孟斐(1972-),女，博士，主任醫師，主要從事宮頸疾病研究。

組織因子途徑抑制物(TFPI)-2具有抑制腫瘤侵襲和轉移的作用〔1〕。研究〔2～4〕發現，在許多類型的人類腫瘤細胞中，都存在編碼TFPI-2基因的抑制及缺失。目前國內外關于TFPI-2在宮頸癌中的研究并不多見，有研究〔5〕顯示，TFPI-2失活可能與宮頸癌細胞的增殖和凋亡有關，但是目前尚缺乏相關報道。本研究分別通過體內和體外實驗觀察TFPI-2在正常宮頸、宮頸上皮內腫瘤(CIN)和宮頸鱗癌組織中表達的差異，及TFPI-2對宮頸癌Hela細胞增殖和凋亡的影響。探討TFPI-2在宮頸癌發生、發展過程中的作用，為尋找新的抗腫瘤治療方法提供思路，為宮頸癌的基因治療尋找新的靶點。

1資料和方法

1.1材料納入2009～2010年在我院婦產科住院治療的患者。其中宮頸鱗癌患者68例，年齡22～71〔平均(43±6)〕歲；CIN患者48例，年齡25～69〔平均(45±5)〕歲；宮頸正常患者12例，為子宮肌瘤患者切除肌瘤時的正常宮頸組織，年齡34～62〔平均(42±3)〕歲。所有患者在取材前均未經放化療及生物和手術治療，均經病理診斷證實，排除宮頸腺癌患者。各組患者年齡無統計學差異。均簽署知情同意書。人宮頸癌Hela細胞購自中科院上海細胞研究所。37℃溫水浴復蘇，高糖DMEM培養基(Hyclon公司)中培養，待細胞長滿80%以上進行傳代，取第3代對數生長期細胞進行實驗。

1.2方法

1.2.1免疫組化染色檢測宮頸組織TFPI-2的表達取宮頸組織，40 g/L多聚甲醛固定后，脫水，浸蠟，包埋，行4 μm厚連續切片，切片常規脫蠟，二甲苯透明，梯度乙醇水化后熱修復抗原；磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗，3%過氧化氫37℃孵育20 min，阻斷內源性過氧化物酶；PBS沖洗，山羊血清封閉。在兔抗人TFPI-2多克隆抗體(1∶160；北京博奧森生物技術有限公司)中4℃孵育過夜；PBS沖洗后生物素標記二抗工作液(北京中山金橋生物技術公司)中37℃孵育15 min；PBS沖洗后滴加辣根過氧化物酶標記的鏈霉卵白素工作液，37℃孵育15 min，二氨基聯苯胺(DAB)顯色(北京中山金橋生物技術公司)，顯微鏡(日本Olympus公司)下控制染色程度，蒸餾水洗滌終止反應，蘇木精復染，自來水沖洗，返藍；梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡觀察。用PBS代替一抗作為陰性對照。由兩名病理科醫師進行盲法閱片，在200倍鏡下隨機選取5個視野進行判讀，細胞質出現棕黃色可以為TFPI-2表達陽性。其中陽性表達75%～100%為強陽性()，50%～75%為次強陽性()，10%～50%為陽性()，<10%為弱陽性(+)，不表達為陰性(-)。

1.2.2細胞轉染目的基因pcDNA3.1-TFPI-2質粒和空白pcDNA3.1質粒均由上海吉凱基因化學有限公司合成。參照Lipofectamine2000試劑盒說明書進行轉染。取對數生長期Hela細胞，胰酶消化，含10%胎牛血清的DMEM重懸細胞，按1×105個細胞接種至培養板，待細胞70%～80%融合后，加入1∶1的脂質體/質粒混合液進行轉染。Hela-TFPI-2組轉染pcDNA3.1-TFPI-2質粒，空白質粒組轉染pcDNA3.1 空白質粒，空白對照組不進行轉染。48 h后G418進行抗性篩選，用于Real-time PCR和Western印跡檢測。

1.2.3Real-time PCR檢測轉染后的宮頸癌細胞Hela中TFPI-2 mRNA的表達按Trizol試劑說明提取各組細胞總RNA，紫外分光光度計檢測RNA完整性和純度，利用cDNA反轉錄試劑盒將RNA反轉錄成cDNA。根據Gen-Bank的人TFPI-2 mRNA序列，以primer5.0設計其上、下游引物序列，由大連寶生物公司合成。Real-time PCR反應體系共20 μl，2×Real-time PCR Master Mix(SYBR Green) 10 μl，模板(cDNA稀釋10倍)2 μl，上、下游引物各0.4 μl (10 μmol/L)，ddH2O 7.2 μl。反應條件：95℃，預變性30 s。95℃變性5 s，60℃退火30 s，72℃延伸1 min，共40個循環。應用Rotor-Gene 3000熒光實時定量PCR儀的Comparative Delta-delta Ct法對獲得的熒光曲線結果進行分析，結果用2-ΔΔCt表示，以DAPDH作為內參。

1.2.4Western印跡法檢測轉染后的宮頸癌細胞Hela中TFPI-2蛋白的表達取各組組織，用細胞裂解液提取蛋白，二喹啉甲酸(BCA)方法測蛋白濃度；調節蛋白濃度一致，取等量蛋白樣品，行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分離蛋白，然后用半干式電轉的方法將蛋白質轉移至聚偏氟丙烯(PVDF)膜上，封閉液室溫封閉2 h，1∶200稀釋的兔抗人TFPI-2多克隆抗體室溫雜交2 h；1∶3 000稀釋的生物素標記的羊抗兔IgG室溫雜交2 h，電化學發光法(ECL)發光，曝光、顯影、定影。應用北京航天航空大學CM-2000B型生物醫學圖像分析系統測量條帶的吸光度值，以β-actin作為內參。

1.2.5四甲基偶氮唑藍比色法(MTT)檢測轉染后的宮頸癌細胞Hela增殖情況分別于轉染后24、48、72 h以0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(EDTA)消化為單細胞懸液后，按照103～104/孔接種于包被過的多聚賴氨酸的96孔板中，0.2 ml/孔，每孔加入5 mg/ml MTT溶液20 μl，繼續培養4 h后終止培養，棄上清，然后每孔加入150 μl二甲基亞砜，振蕩10 min，于酶免分析儀490 nm測定吸光度(A)值。

1.2.6流式細胞儀檢測轉染后的宮頸癌細胞Hela的凋亡情況胰酶消化收集細胞，4℃PBS洗細胞，重懸，調細胞濃度為1×106/ml，流式細胞凋亡雙染色法(Annexin V/FITC和PI)雙染細胞，上流式細胞儀分別檢測細胞凋亡。其中左上象限為壞死和晚期凋亡細胞(Annexin-/PI+)、右上象限為壞死細胞(Annexin+/PI+)、左下象限為正常活細胞(Annexin-/PI-)、右下象限為早期凋亡細胞(Annexin+/PI-)。

2結果

2.1正常宮頸、CIN及宮頸鱗癌組織TFPI-2的表達免疫組化染色結果顯示TFPI-2蛋白主要表達在胞質中，呈棕黃色，在正常宮頸上皮組織TFPI-2表達較高，染色較均一；而在宮頸鱗癌組織中表達較低或不表達，CIN組織表達介于正常宮頸組織和宮頸鱗癌組織之間。三者間兩兩比較差異顯著(P<0.01)，見表1，圖1。

表1宮頸癌與CIN，正常宮頸組織中TFPI-2表達比較(n)

組別n-+正常宮頸組織12000210CIN組織480219198宮頸癌組織6820281820

圖1　正常宮頸、CIN及宮頸癌組織中TFPI-2的表達(免疫組化染色，×200)

2.2TFPI-2基因轉染后宮頸癌細胞Hela中TFPI-2 mRNA及蛋白的表達實驗應用real-time PCR檢測轉染后各組細胞酸氨酸磷酸酶2(SHP-2)mRNA的表達，結果顯示，Hela-TFPI-2組細胞TFPI-2 mRNA的表達量為8 652.12±351.04，明顯高于轉染空白質粒組的1.01±0.05和空白對照組的1.00±0.10(P<0.01)，而空白質粒組和空白對照組間TFPI-2 mRNA的表達無明顯差異(P>0.05)，可見pcDNA3.1-TFPI-2質粒可成功將TFPI-2基因轉染至Hela細胞，并在細胞中表達。同時，實驗采用Western印跡檢測轉染后各組細胞SHP-2蛋白的表達，其結果與real-time PCR結果一致，見圖2。

圖2　Western印跡檢測轉染后各組Hela細胞中 TFPI-2蛋白的表達

2.3TFPI-2基因轉染對Hela細胞增殖的影響應用MTT法分別于轉染后24 h，48 h，72 h各組細胞的吸光度值進行檢測發現，與空白質粒組和空白對照組比較，各時間Hela-TFPI-2組的吸光度值明顯降低(P<0.05)，且隨著培養時間的延長，各組的差異更明顯。說明TFPI-2基因轉染可明顯抑制Hela細胞的增殖，見圖3。

圖3　TFPI-2對宮頸癌HeLa細胞增殖的影響

2.4TFPI-2基因轉染對Hela細胞凋亡的影響實驗應用流式細胞儀Annexin V/PI雙染法檢測TFPI-2基因轉染后各組細胞的凋亡情況，結果顯示Hela-TFPI-兩組細胞凋亡率為(5.46±0.52)%，而空白對照組和空白質粒組的細胞凋亡率分別為(1.25±0.14)%和(1.23±0.20)%，統計學結果顯示，Hela-TFPI-兩組的細胞凋亡率明顯高于空白對照組和空白質粒組，而空白對照組和空白質粒組的細胞凋亡率間差異無顯著性意義。

3討論

目前對宮頸癌的治療包括手術、放療、化療等，但仍有大量的患者復發而死亡。隨著對腫瘤發生發展分子機制研究的不斷深入，惡性腫瘤的基因治療已成為當前腫瘤研究的熱點。

TFPI-2，又稱胎盤蛋白-5，定位于7號染色體7q22，體內主要以相對分子質量為32 000的形式存在于內皮細胞和成纖維細胞的ECM中。TFPI-2分子共由5個部分組成：富含酸性氨基酸的N端、3個首尾相連的Kunitz結構域和富含堿性氨基酸的C端。TFPI-2通過Kunitz結構域與蛋白水解酶結合來抑制其活性〔6～8〕。TFPI-2屬于Kunitz型絲氨酸蛋白酶抑制劑家族蛋白，是一種廣譜的絲氨酸蛋白酶抑制物，研究發現TFPI-2能夠抑制ECM相關的胰蛋白酶，纖溶酶，凝血因子Ⅶ(FⅦa)/組織因子復合物等從而維持ECM結構的完整性。同時，TFPI-2可以通過抑制纖溶物和MMPs的活性〔9〕，以及下調血管生成因子(VEGF)的表達抑制腫瘤新生血管的生成，間接抑制腫瘤細胞的增殖〔10〕。研究發現TFPI-2降解絲氨酸的蛋白產物可以結合細胞凋亡受體，引導細胞程序性死亡，從而導致腫瘤細胞凋亡增加，發揮其抗腫瘤效應〔11～13〕。

實驗中宮頸癌組織中的TFPI-2表達明顯低于正常宮頸組織和CIN組織，可能是TFPI-2的表達減少，導致其與MMPs的結合降低，無法抑制MMPs的活性及血管形成，進而促進了宮頸癌的形成和發展。本實驗提示，TFPI-2處理與MMPs作用應用ECM的完整性及影響腫瘤血管生成以外，其對宮頸癌的抑制作用還與其他因素有關，有待進一步的研究。

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〔2013-06-10修回〕

(編輯袁左鳴)