香煙煙霧提取物對Ⅱ型肺泡上皮細胞中Derlin-1表達的影響

香煙煙霧提取物對Ⅱ型肺泡上皮細胞中Derlin-1表達的影響

彭艷胡瑞成1

(長沙市第一醫院呼吸科，湖南長沙410000)

摘要〔〕目的探討香煙煙霧提取物(CSE)對Ⅱ型肺泡上皮細胞中Derlin-1蛋白及其mRNA表達的影響。方法體外培養Ⅱ型肺泡上皮細胞(A549)，加入10%濃度的CES作用于細胞0、3、6、12、24、48 h，采用免疫蛋白印跡(WB)檢測Derlin-1蛋白表達水平的變化，并運用逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測Derlin-1 mRNA含量的變化。結果10%濃度的CSE作用下，Derlin-1蛋白的表達逐漸提高，并在6 h達最高，隨后逐漸下降，Derlin-1 mRNA含量變化與Derlin-1蛋白表達一致。結論香煙煙霧可影響Ⅱ型肺泡上皮細胞中Derlin-1表達的變化，可能與Derlin-1是內質網應激誘導凋亡的抑制劑有關。

關鍵詞〔〕香煙煙霧提取物；Ⅱ型肺泡上皮細胞；Derlin-1； 內質網應激

中圖分類號〔〕R3〔

基金項目：國家自然科學基金(No.81070035)；湖南省科技計劃項目(No.2009JT3054)；湖南省醫藥衛生科研項目(No.B2008-026)

通訊作者：胡瑞成(1973-)，男，博士，主任醫師，主要從事呼吸系統疾病研究。

Effect of cigarette smoke extract on the expressional levels of Derlin-1 in alveolar type Ⅱ cells

PENG Yan, HU Rui-Cheng.

Department of Respiratory,the First Hospital of Changsha City,Changsha 410000,Hunan,China

Abstract【】ObjectiveTo explore the effect of cigarette smoke extract(CSE) on expressional levels of Derlin-1 protein and mRNA in the cultured A549 cells those were rat alveolar typeⅡ cells lines. MethodsWestern blot was used to detect the level of Derlin-1 protein expression exposured to 10% concentration of CSE at different time (0,3,6,12,24,48 h). RT-PCR was used to measure the change of Derlin-1 mRNA. ResultsIn 10% concentration of CSE, Derlin-1 protein expression gradually was increased and reached the highest at 6 h and then decreased gradually. RT-PCR results consistented with the result of Western blot. ConclusionsCigarette smoke can affect the changes of the expression of Derlin-1 in alveolar typeⅡ cells, which may be associated with that Derlin-1 is the apoptosis inhibitor of endoplasmic reticulum stress.

【Key words】Cigarette smoke extract; Alveolar epithelial cells; Derlin-1; Endoplasmic reticulum stress

1湖南省老年醫院-湖南省老年醫學研究所呼吸疾病研究室

第一作者：彭艷(1984-)，女，碩士，醫師，主要從事呼吸系統疾病研究。

吸煙是引起慢性阻塞性肺疾病(COPD)主要的危險因素之一。近年來研究表明香煙煙霧中的氧化物質可導致肺結構細胞發生內質網應激，加速肺組織損傷和肺功能減退，從而促進COPD的發生發展〔1，2〕。Derlin-1也稱內質網相關降解蛋白1，是位于內質網的跨膜蛋白，其與內質網相關降解有密切關系〔3，4〕。Derlin-1具有緩解內質網應激的作用。但是，目前對Derlin-1在COPD中的作用缺乏研究。Ⅱ型肺泡上皮細胞功能狀態是決定肺損傷病理轉歸的主要因素，在COPD發病中起重要作用〔5〕。本研究探討香煙煙霧提取物(CSE)對Ⅱ型肺泡上皮細胞中Derlin-1表達的影響。

1材料與方法

1.1主要試劑及儀器A549細胞(本實驗室保存)，芙蓉牌香煙(湖南中煙工業有限責任公司，尼古丁1.0 mg/支，焦油12 mg/支)；胎牛血清、DMEM購自Gibco公司；反轉錄試劑盒、Trizol Reagent、Derlin-1和β-actin引物均來自Invitrogen公司；PCR試劑盒(PCR Master Mix)購于Fermentas公司；DNA Marker 2000購自TaKaRa；總蛋白提取試劑盒(強裂解液和蛋白酶抑制劑)，Bradford蛋白濃度測定試劑盒購自碧云天生物研究所；抗Derlin-1抗體(SANTA公司)，β-actin(武漢博士德)；辣根過氧化物酶標記的二抗(抗兔IgG與抗鼠IgG 北京中杉公司)；ECL底物發光試劑盒購自Thermo公司；低溫高速離心機為美國Beckman公司；普通PCR擴增儀為ABI9600；水平電泳儀(北京六一儀器公司)；紫外分光光度計(上海江儀)；凝膠成像分析系統為中國北京天能，TannonGis-2010型；垂直電泳儀為BIO-RAO公司產品。

1.2方法

1.2.1CSE的制備參照文獻〔6〕的方法，取兩支去過濾嘴香煙，通過改造的20 ml注射器抽把煙霧抽入50 ml不含血清的DMEM中，用1 mol/L的NaOH調pH為7.4，用0.22 μm孔徑的孔濾膜過濾，所得溶液在30 min內用于后續實驗。

1.2.2細胞培養A549細胞在含10%胎牛血清(10%FBS)、100 U/ml青霉素、100 U/ml鏈霉素的DMEM培養液中培養，在37℃含5%的CO2培養箱中傳代至第3代在6孔板中調整細胞密度至4×105～5×105，用無血清DMEM漂洗2次后，加入10%濃度的CSE進行刺激，分別培養0，3，6，12，24，48 h，收集細胞用于后續Western印跡法和PCR檢測。

1.2.3Western印跡檢測各組細胞中Derlin-1蛋白的表達收集細胞，加入適量預冷的蛋白裂解液，冰上裂解細胞，Bradford法檢測所提蛋白濃度，取30 μg總蛋白樣品液上樣，進行SDS-PAGE轉膜，用Derlin-1 (1∶200)、β-actin (1∶1 000)、辣根過氧化物酶標記的二抗IgG(1∶2 000)，最后用ECL將我發光試劑顯色，掃描膠片并用Gel pro4.0 版凝膠光密度分析軟件分析條帶的灰度值，重復實驗3次。

1.2.4 RT-PCR檢測各組細胞Derlin-1 mRNA的表達收集各組細胞約106～107按說明書加1 ml Trizol試劑裂解細胞，再用氯仿抽提，異丙醇和75%乙醇洗滌沉淀，用無Rnase的雙蒸水溶解RNA，采用紫外分光光度計檢測RNA濃度及純度；以所提RNA為模板按逆轉錄試劑盒說明合成互補脫氧核糖核酸(cDNA),以cDNA作為模板進行聚合酶鏈式反應；Derlin-1上游引物：5′-GCTCATTGGAAACCTTGTCG -3′，下游引物：5′- CCACCTCCGCCATTCTGAT -3′，擴增產物為：195 bp，退火溫度：55℃；β-actin 上游引物：5′-TCACCCACACTGTGCCCATCTATGT-3′，下游引物：5′-CATCGGAACCGCTCATTGCCGATAG-3′,擴增產物為295 bp，退火溫度：61.5℃。PCR反應條件：94℃預變性3 min,94℃變性30 s，反應完成后72℃延伸5 min。擴增產物10 μl經1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像系統掃描后，Gel pro4.0版凝膠光密度分析軟件分析擴增產物條帶，分別測定各擴增帶吸光度值，將目的基因與內參照β-actin擴增帶的吸光度比值作為其mRNA相對表達水平，重復實驗3次。

1.3統計學方法采用SPSS13.0軟件進行單因素方差分析及SNK-q檢驗。

2結果

2.1各組細胞中Derlin-1蛋白的表達大鼠Ⅱ型肺泡上皮細胞在10%濃度CES刺激下，Derlin-1蛋白表達先增高后降低，6 h表達最高(P<0.05)，見表1、圖1。

組別Derlin-1蛋白Derlin-1mRNA0h組12.34±0.692.20±0.103h組15.41±1.181)4.07±0.151)6h組22.26±3.021)2)6.13±0.811)2)12h組18.90±1.581)2)3)3.83±0.211)3)24h組16.95±1.361)3)3.63±0.311)3)48h組14.66±2.373)4)3.10±0.101)2)3)4)F/P值16.82/0.0037.11/0.00

與0 h比較：1)P<0.05；與3 h比較：2)P<0.05；與6 h比較：3)P<0.05；與12 h比較：4)P<0.05

圖1　10%CSE對A549細胞中Derlin-1蛋白表達的影響

2.2Derlin-1 mRNA在各組細胞中的表達用濃度10%的CSE刺激Ⅱ型肺泡上皮細胞，Derlin-1 mRNA先增高后降低，6 h達最高(P<0.05)，見表1，圖2。

圖2　10%CSE濃度對A549細胞中Derlin-1 mRNA表達的影響

3討論

Derlin-1是內質網上的跨膜蛋白，主要分布于細胞內質網中，由4個跨膜區域組成，其氨基端與羧基端均存在于胞液中〔7～9〕。錯誤折疊或者未折疊蛋白在內質網中堆積引發內質網應激。持續或者嚴重的內質網應激導致細胞凋亡。研究發現錯誤折疊蛋白通過Derlin-1從內質網中跨膜轉運到胞質中，隨后被蛋白酶體所降解，從而緩解內質網應激〔10〕。因此Derlin-1是內質網誘導凋亡的抑制劑，介導內質網相關降解〔11，12〕。香煙煙霧中的有害成分可導致內質網應激〔13〕。本研究表明在10%CSE作用下，Ⅱ型肺泡上皮細胞中Derlin-1蛋白的表達先增高后降低，6 h達最高，在時間上有一定的依賴性。本實驗室前期研究表明，香煙煙霧可導致大鼠COPD，并與內質網應激有直接的關系〔14〕。因此，Derlin-1可能參與香煙煙霧導致COPD的發病過程中，然而其具體的機制還有待進一步研究。

4參考文獻

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〔2012-12-12修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢園)