高脂飲食對大鼠骨骼肌脂質中間代謝產物的影響及機制

高脂飲食對大鼠骨骼肌脂質中間代謝產物的影響及機制

張雪梅任路平1宋光耀1甘可欣1王超2孔德賢聶倩

(河北省人民醫院風濕免疫科，河北石家莊050000)

摘要〔〕目的觀察高脂飲食對大鼠骨骼肌脂質中間代謝產物的沉積及脂肪酸代謝中CD36及CPT1的影響。方法雄性SD大鼠隨機分為正常對照組、高脂飲食組，分別喂養12 w，分別測定大鼠血糖(BG)及胰島素(INS)水平；透射電鏡觀察大鼠骨骼肌線粒體形態變化；GPO-PAP法檢測骨骼肌甘油三酯(TG)，ELISA試劑盒檢測骨骼肌甘油二酯(DAG)、神經酰胺(CER)、長鏈脂酰輔酶A(LCCoAs)的變化；用RT-PCR和Western 印跡的方法分析大鼠骨骼肌CD36及CPT1的mRNA和蛋白的表達。結果與對照組相比，高脂組大鼠BG及INS水平均明顯升高，GIR明顯降低(P<0.01)；同時骨骼肌組織中TG、DAG、CER及LCCoAs含量明顯升高(P<0.01)。與對照組相比高脂組骨骼肌細胞內可見大量大小不等的脂滴分布，線粒體腫脹，內外膜部分融合，線粒體嵴變少變短，部分或全部消失，甚至出現空泡化。與對照組相比，高脂組CD36的mRNA及蛋白的表達明顯升高，CPT1的表達明顯降低(P<0.05)。結論高脂飲食可引起大鼠胰島素抵抗及骨骼肌組織中脂質中間代謝產物的堆積，肌內脂質堆積與脂肪酸代謝中關鍵酶CD36、CPT1表達的變化有關。

關鍵詞〔〕胰島素抵抗；骨骼肌；神經酰胺；甘油二酯；長鏈脂酰輔酶A

中圖分類號〔〕R587〔

基金項目：國家自然科學基金(30971391)

通訊作者：宋光耀 (1958-)，男，博士，主任醫師，教授，博士生導師，主要從事內分泌系統及相關疾病研究。

1河北省人民醫院內分泌科2河北省人民醫院臨研中心

第一作者：張雪梅 (1986- )，女，碩士，主要從事內分泌系統及相關疾病研究。

近年來研究認為，骨骼肌組織內脂代謝中間產物如甘油二酯(DAG)、神經酰胺(CER)、長鏈脂酰輔酶A(LCCoAS)的沉積增加是誘導骨骼肌胰島素抵抗(IR)的主要原因〔1〕。脂肪酸是人及哺乳動物的主要能源物質，脂肪酸的攝入超出其氧化能力是骨骼肌內脂肪堆積的主要原因〔2〕。脂肪酸轉位酶CD36是促進骨骼肌細胞攝取脂肪酸的重要膜蛋白〔3〕。進入細胞中的脂肪酸必須進入線粒體內才能進行代謝。而肉堿脂酰轉移酶CPT1在脂肪酸由胞液向線粒體基質的轉運中起關鍵作用〔4〕。本研究探討高脂飲食對脂代謝相關蛋白基因表達的影響。

1材料與方法

1.1模型建立6周齡雄性SD大鼠30只，體重100～120 g，按隨機數字表隨機分為對照組及高脂組各15只。對照組進食普通飼料(配方：碳水化合物65.5%、蛋白質24.2%、脂肪10.3%)，高脂組進食高脂飼料(配方：碳水化合物20.1%、蛋白質20.1%、脂肪59.8%)，分別喂養12 w后行相關指標的測定，之后腹主動脈取血處死大鼠，留取骨骼肌組織。

1.2觀察指標及檢測方法

1.2.1高胰島素正葡萄糖鉗夾試驗2組大鼠喂養12 w后，從每組隨機選取大鼠6只，清醒狀態下進行正常葡萄糖高胰島素鉗夾實驗。在實驗前清晨，給予大鼠 3%戊巴比妥鈉麻醉，右側頸動脈和頸靜脈插管，管腔內注入肝素抗凝，末端由實芯不銹鋼針封閉，由皮下延伸到頸后并固定。經 4～5 d的術后恢復，使動物在清醒、自由活動下進行鉗夾試驗。術中胰島素輸注速度為4 mU·kg-1·min-1，葡萄糖濃度為30%，具體步驟參見文獻〔5〕。計算GIR=穩態時葡萄糖輸注速率×葡萄糖濃度×1 000/體重(kg)/60，作為評價大鼠胰島素敏感性的指標。

1.2.2血清指標的測定2組大鼠喂養12 w，空腹12 h后，腹主動脈取血5 ml，測定空腹血糖(BG，美國 Roche 公司血糖儀)、空腹胰島素 (INS，ELISA方法，試劑盒由BLUE GENE公司提供)。

1.2.3透射電鏡觀察肌細胞線粒體形態的變化順肌絲方向迅速剪取大鼠比目魚肌放入事先預冷的4%戊二醛中，做好標記，迅速切成1 mm×1 mm×1 mm組織塊固定，經1%鋨酸后固定，常規清洗、脫水、浸透，Epon812包埋，超薄切片，鉗鈾染色，日立H-7500型透射電子顯微鏡觀察、照相。

1.2.4骨骼肌組織脂質沉積指標的測定取骨骼肌組織30 mg經氯仿/甲醇抽提甘油三酯(TG)后,加入0.6%NaCl分離水相和有機相，吸取有機相待干燥后溶于100%乙醇500 μl，應用過氧化物耦聯 (GPO-PAP)試劑盒測定TG含量 (Roche，USA)。骨骼肌組織中DAG、CER及LCCoAs由相應的ELASIA試劑盒進行測定(試劑盒由BLUE GENE公司提供)。

1.2.5骨骼肌組織CPT1及CD36 mRNA的檢測應用實時熒光定量RT-PCR進行檢測。采用總RNA抽提試劑(Trizol)提取組織總RNA,用EasyScript First-strand cDNA synthesis SuperMix試劑盒(北京全式金生物技術有限公司提供)逆轉錄成cDNA，ABI PRISM 7300實時熒光定量PCR儀(Applied Biosystems, USA)進行聚合酶鏈反應檢測骨骼肌CPT1 mRNA及CD36 mRNA的含量。PCR體系20 μl，Syber Green Ⅰ GoTAq?qPCR MAster Mix(PromegA, USA)10 μl，引物2 μl，cDNA 8 μl。反應條件：95 ℃預變性5 min，然后95 ℃變性15 s，58 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s,進行40個循環。數據處理采用7300 Systerm SDS Software 進行數據處理。引物序列，GAPDH正義：TGAACGGGAAGCTCACTG，反義GCTTCACCACCTTCTTGATG；CPT1正義：CCAGGCAAAGAGACAGACTTG；反義GCCAAACC TTAGAGAAGCGAC；CD36正義：AATGAGACTGGGACCATCG；反義CTCCAACACCAAGTAAGACCAT。

1.2.6Western 印跡檢測骨骼肌組織CPT1、CD3650 mg骨骼肌組織放入冰水浴中1.5 ml EP管內，每管加入0.5 ml裂解液〔100 mmol/L Tris-HCl, pH8.0, 1 mmol/L乙二醇乙二醚二胺四乙酸(EGTA),1 mmol/L乙二胺四乙酸 (EDTA),1 mmol/L苯甲基磺酰氯 (PMSF),1 mg/L亮抑酶肽,1 mg/L抑肽酶,50 mg/L胰蛋白酶〕，勻漿后分離上清,用考馬斯亮藍試劑盒進行蛋白定量。取50 μg蛋白進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳,濕法電轉移至硝酸纖維素膜上, 5%脫脂奶粉室溫封閉4 h后,分別加入CPT1 、CD36和GAPDH多克隆抗體(Santa Cruz, Europe提供), 4℃ 過夜,充分洗膜后加入HRP標記的二抗室溫孵育2 h, 最后用增強化學發光法 (ECL)檢測,膜與化學發光底物孵育,經 X膠片曝光顯影。用IMAGEJ軟件分析 ,以目的蛋白的灰度值除以內參GADPH的灰度值以校正誤差 ,所得結果代表某樣品的目的蛋白相對含量。每組隨機選 6例樣本進行蛋白表達分析 ,測定骨骼肌CPT1及CD36的蛋白表達量。

2結果

2.112 w后2組大鼠生化指標比較高脂組血糖及胰島素水平較對照組明顯升高(P<0.01)，葡萄糖輸注率(GIR)明顯低于對照組(P<0.01)。見表1。

組別BG(mmol/L)INS(mU/L)GIR(mg·kg-1·min-1)對照組5.6±0.5285±3.229.8±2.3高脂組7.5±0.41)41.6±3.61)17.2±2.41)

與對照組比較：1)P<0.01；下表同

2.2骨骼肌組織脂質沉積情況與對照組相比，大鼠骨骼肌組織中TG、DAG、CER及LCCoAs含量均明顯增加(P<0.01)。見表2。

組別TG(μmol/g)DAG(nmol/g)CER(nmol/g)LCCoAs(nmol/g)對照組9.5±0.8210.5±3066.2±11.22.1±0.3高脂組27.8±1.71)568.0±45.31)132.3±8.31)6.2±0.71)

2.3骨骼肌細胞線粒體形態改變與對照組相比高脂組骨骼肌細胞內可見大量大小不等的脂滴分布，線粒體腫脹，內外膜部分融合，線粒體嵴變少變短，部分或全部消失，甚至出現空泡化(圖1)。

A：對照組，B：高脂組，M：線粒體，L：脂滴 圖1　骨骼肌線粒體電鏡結果(×15 000)

2.4骨骼肌組織CPT1及CD36的表達高脂喂養8 w后與正常對照組(0.832±0.102、0.448±0.069)相比，高脂組骨骼肌組織中CD36(1.173±0.162，0.763±0.070)在mRNA，蛋白水平的表達均明顯升高(P<0.01)，CPT1在mRNA(對照組vs高脂組：1.002±0.120 vs 0.285±0.058)及蛋白(對照組vs高脂組：0.989±0.076 vs 0.569±0.069)水平的表達均明顯降低(P<0.05)。

3討論

高脂飲食喂養可以導致大鼠血糖及胰島素水平明顯升高，葡萄糖輸注率明顯下降，誘導大鼠產生胰島素抵抗。同時伴隨著骨骼肌組織線粒體形態的變化及骨骼肌組織中脂質及其中間代謝產物的累積。而在脂肪酸轉運及代謝過程中的關鍵酶CD36的表達明顯升高，CPT1的表達明顯下降。

近年來，有學者提出2型糖尿病中糖代謝紊亂的根源為脂代謝的異常，脂毒性與胰島素抵抗有明確的相關性，以往研究認為大量脂肪在肌肉、肝臟和β細胞等組織的積聚為2型糖尿病發病的重要因素。骨骼肌是機體利用葡萄糖的主要場所。在胰島素的刺激下，骨骼肌吸收了機體葡萄糖總攝取量的 75%以上。因此骨骼肌對葡萄糖的攝取、利用障礙是機體發生胰島素抵抗的重要發病機制。近期研究表明，活性的脂代謝中間產物如：LCCoAs、DAG、CER等的含量與肌細胞對胰島素的敏感性成負相關，是誘導骨骼肌 IR 的主要原因〔1〕。

胰島素刺激組織攝取利用葡萄糖是通過胰島素受體-胰島素受體底物1-磷脂酰激醇-3激酶-蛋白激酶(PK)B等一系列信號傳導過程完成的，最終使葡萄糖轉運蛋白(GLUT)4轉移到細胞膜，大量GLUT4的膜轉移可加速葡萄糖攝入到細胞內。胰島素信號轉導通路中任一步驟的異常都可能最終阻礙骨骼肌轉運葡萄糖，從而引起IR〔6〕。LCCoAs是細胞內脂肪酸存在的活性形式，它可轉化成DAG及神經酰胺，DAG可以通過激活PKC抑制胰島素受體和胰島素受體底物酪氨酸激酶的活性進而干擾胰島素信號傳導系統，導致IR形成〔7〕。而CER主要通過抑制胰島素受體底物-1信號傳導通路的下游PKB/AKT的磷酸化來發揮作用〔8〕。近期研究顯示，CER抑制劑或者催化CER代謝為葡萄糖神經酰胺的物質能夠改善IR〔9〕。對Zucker糖尿病肥胖大鼠進行二甲雙胍和運動鍛煉的干預時發現，胰島素敏感性改善的同時伴隨著肌肉組織中DAG和CER含量的減少〔3〕。

脂肪酸的攝入超出其氧化能力通常被認為是骨骼肌內脂肪堆積的主要原因。高脂飲食喂養可以導致大鼠血液中脂肪酸含量增加，短鏈及中鏈脂肪酸可直接通過被動轉運進入細胞膜，長鏈脂肪酸(LCFA)的攝入需要膜上蛋白質的介導。脂肪酸轉位酶CD36是促進骨骼肌細胞攝取長鏈脂肪酸的重要膜蛋白。長鏈脂肪酸在細胞內轉變為活性形式LCCoAs后在關鍵酶肉堿脂酰轉移酶(CPT)-1的作用下進入線粒體最終被骨骼肌氧化利用。

而線粒體是三大營養物質代謝的最終場所，線粒體功能的損害被認為是胰島素抵抗發病機制的關鍵因子。除了功能的改變外，線粒體形態在胰島素抵抗狀態下也發生了改變。人類 2型糖尿病患者或者肥胖個體骨骼肌線粒體體型較小 ,而且呈現較大空泡〔10〕。WBN /Kob糖尿病大鼠表現為線粒體腫脹、線粒體嵴空化〔11〕。

在本次研究中，我們觀察到高脂喂養12 w后，MFN2表達量明顯下降的同時伴隨著CPT1表達的下降，從而造成已轉移進入骨骼肌細胞內的脂質及其中間代謝產物不能被進一步轉移進入線粒體進行β氧化，進而積聚在胞液中，損害了胰島素信號通路的一個或多個環節，干擾了葡萄糖的轉運，造成血糖升高，胰島素抵抗。同時我們發現高脂飲食誘導大鼠發生胰島素抵抗的同時伴隨著線粒體超微結構的損傷，線粒體形態的變化與功能的改變密切相關。線粒體的損傷會進一步加重骨骼肌組織脂質代謝的紊亂，脂質及其中間代謝產物在骨骼肌組織中堆積又加重胰島素抵抗，形成惡性循環。

4參考文獻

1Bergman BC,Perreault L,Hunerdosse DM,etal. Increased intramuscular lipid synthesis and low saturation relate to insulin sensitivity in endurance-trained athletes〔J〕. J Appl Physiol,2010;108(5):1134-41.

2Abumrad N,Harmon C,Ibrahimi A. Membrane transport of long-chain fatty acids: evidence for a facilitated process〔J〕. J Lipid Res,1998;39(12):2309-18.

3Smith AC,Mullen KL,Junkin KAetal. Metformin and exercise reduce muscle FAT/CD36 and lipid accumulation and blunt the progression of high-fat diet-induced hyperglycemia〔J〕.J Physiol Endocrinol Metab,2007;293(1):E172-81.

4Sebastian D,Herrero L,Serra D,etal. CPT I overexpression protects L6E9 muscle cells from fatty acid-induced insulin resistance〔J〕. Am J Physiol Endocrinol Metab,2007;292(3):E677-86.

5Kraegen EW,James DE,Bennett SP,etal. In vivo insulin sensitivity in the ratdetermined by euglycemic-clamp〔J〕.Am J Physiol,1983;245(1):E1-7.

6Mohammad A,Sharma V,McNeill JH. Vanadium increases GLUT4 in diabetic rat skeletal muscle〔J〕. Mol Cell Biochem,2002;233(1-2):139-43.

7Turban S,Hajduch E. Protein kinase C isoforms: mediators of reactive lipid metabolites in the development of insulin resistance〔J〕. FEBS Lett,2011;585(2): 269-74.

8Penkov DN,Egorov AD,Mozgovaya MN. Insulin resistance and adipogenesis: role of transcription and secreted factors〔J〕. Biochemistry,2013;78(1):8-18.

9Holland WL,Brozinick JT,Wang LPetal. Inhibition of ceramide synthesis ameliorates glucocorticoid-,saturated-fat-,and obesity-induced insulin resistance〔J〕. Cell Metab,2007;5(3):167-79.

10Kelley DE,He J,Menshikova EV,etal. Dysfuncti on of mitochondria in human skeletal muscle in type 2 diabetes〔J〕. Diabetes,2002;51(10): 2944-50.

11Bach D,Pich S,Soriano FX,etal. Mitofusin2 determines mitochondrial net work architecture and mitochondrial metabolism: a novel regulatorymechanism altered in obesity〔J〕. J Biol Chem,2003;278(19): 17190-7.

〔2012-11-17修回〕

(編輯曲莉)