海藻糖對異氟烷誘導轉APP基因小鼠學習記憶功能的影響

海藻糖對異氟烷誘導轉APP基因小鼠學習記憶功能的影響

張成媛樸美花劉楠苑野馮春生

(吉林大學第一醫院麻醉科，吉林長春130021)

摘要〔〕目的探討吸入麻醉藥異氟烷對轉APP基因小鼠學習記憶功能的影響及海藻糖的干預保護作用。方法60只12月齡轉APP小鼠隨機分為空白對照組(Control組)、異氟烷組(Iso組)、海藻糖組(Iso+Tre組)，每組20只。Iso+Tre組和Iso組分別于麻醉前30 min腹腔注射海藻糖400 μg/kg或等量生理鹽水，然后給予1.4 %異氟烷吸入麻醉2 h，麻醉后24 h應用Morris水迷宮測試小鼠學習記憶能力，麻醉后6、24 h殺鼠取腦，采用TUNEL染色觀察各組小鼠海馬區神經元凋亡，應用ELISA法檢測Aβ含量，Western印跡法檢測Bcl-2、Bax、Caspase-3的表達變化。結果與Control組相比，Iso組小鼠總體的平均逃避潛伏期明顯延長，空間探索時間明顯縮短(P<0.01)，海馬神經元凋亡指數、Aβ含量、Bax/Bcl-2比值及Caspase-3表達均明顯增加(P<0.01)；Iso+Tre組與Iso組相比，逃避潛伏期縮短，空間探索時間延長(P<0.05)，Aβ含量、Bax/Bcl-2比值及Caspase-3表達均明顯減少(P<0.01)。結論海藻糖能夠改善異氟烷誘導轉APP基因小鼠學習記憶能力的損害，減少海馬神經元的凋亡及Aβ的生成。

關鍵詞〔〕海藻糖；異氟烷；學習記憶；β-淀粉樣蛋白；神經元凋亡

中圖分類號〔〕R338；R614〔

基金項目：國家自然科學基金資助項目(No. 81271215；No.81141065)

通訊作者：馮春生(1971-)，男，副教授，碩士生導師，主要從事麻醉學研究。

第一作者：張成媛(1984-)，女，在讀碩士，主要從事全麻藥對學習記憶功能的影響及其機制研究。

Effects of trehalose on learning and memory impairment induced by isoflurane in APP transgenic mice

ZHANG Cheng-Yuan, PIAO Mei-Hua, LIU Nan,etal.

Department of Anestic, the First Hospital, Jilin University, Changchun 130021, Jilin, China

Abstract【】ObjectiveTo observe the influence of inhalation anesthestic isoflurane on the learning-memory ability of APP transgenic mice and protective effects of trehalose.Methods60 APP transgenic mice at the age of 12 months were divided into control, Iso and Iso+Tre groups. The abilities of learning and memory were investigated by Morris water maze. TUNEL assay was employed to observe the hippocampal neuron apoptosis of the mice in each group. The amount of Aβ was checked by ELISA assay kit and the variations of Bcl-2, Bax, Caspase-3 were examined by Western blot.ResultsIn comparison with those of control group, the mean escape latency of Iso group was prolonged, the spatial exploring time was reduced, apoptotic index, the amount of Aβ, the ratio of Bax/Bcl-2, and the expression of Caspase-3 were increased. Moreover, compared to those of Iso group, escape latency of Iso+Tre was shorter, longer spatial exploring time was longer, the amount of Aβ, ratio of Bax/Bcl-2, and Caspase-3 expression were lower.ConclusionsTrehalose could improve the recovery of the learning and memory of APP transgenic mice after isoflurane anesthesia, the hippocampal neuron apoptosis and the production of Aβ can be inhibited by trehalose.

【Key words】Trehalose; Isoflurane; Learning and memory; Amyloid β-peptide; Neuron apoptosis

一些研究認為〔1，2〕，異氟烷等吸入麻醉藥可能引起神經細胞凋亡，增加β-淀粉樣蛋白(Aβ)的沉積，加重阿爾茨海默病(AD)患者的認知功能障礙，成為AD發生發展的潛在危險因素。海藻糖是一種穩定的非還原性二糖，因其對生物分子的特殊保護作用，目前已廣泛應用于醫學領域。目前已有報道認為〔3〕，海藻糖能夠減輕Aβ寡聚體的神經毒性，抑制細胞死亡，阻斷和逆轉神經退行性疾病的病理過程。本研究以轉淀粉樣前體蛋白(APP)基因小鼠作為AD動物模型，觀察海藻糖對吸入麻醉藥異氟烷誘導轉APP小鼠空間學習和記憶功能損害的影響。

1材料和方法

1.1實驗動物及分組12月齡轉APP基因小鼠60只(吉林大學白求恩醫學院實驗動物中心提供)，雌雄各半，體重18～22 g，隨機分為三組(n=20)：空白對照組(Control組)、異氟烷組(Iso組)、海藻糖組(Iso+Tre組)。

1.3方法

1.3.1模型制備Iso+Tre組于麻醉前30 min給予腹腔注射海藻糖(400 μg/kg，稀釋于2 ml生理鹽水中)，Iso組腹腔注射2 ml生理鹽水。將轉APP基因小鼠置于自制的麻醉箱中，并連于麻醉機螺紋管回路中，吸氧濃度60%，氧流量1 L/min，先給予轉APP基因小鼠3 %異氟烷進行麻醉誘導，待翻正反應消失〔約(10±2)min〕后，給予1.4 %異氟烷持續吸入2 h，Control組不給任何藥物，只吸入含60%氧氣的空氧混合氣體2 h。麻醉過程中維持小鼠自主呼吸，觀察小鼠皮膚顏色及呼吸頻率，麻醉結束后置于氧濃度為60 %的環境中自然蘇醒。

1.3.2行為學檢測每組隨機抽取8只轉APP基因小鼠于麻醉后24 h開始進行Morris水迷宮實驗，水池直徑120 cm，高60 cm，水溫(25±1)℃，等分成Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ四個象限，實驗歷時6 d，第1～5天為定位航行實驗，圓形平臺直徑6 cm，置放于第Ⅲ象限正中，低于水面1 cm。分別將三組小鼠從4個象限面向池壁放入水中，入水至登上隱蔽平臺的時間為逃避潛伏期，每只小鼠每天于固定時間段訓練4輪，計算某時間段的平均逃避潛伏期。第6天將平臺撤除，進行空間探索實驗，選定和原平臺區域對應的象限終點為入水點，記錄小鼠120 s內在原平臺所在象限的滯留時間，即為空間探索時間。

1.3.3海馬組織切片原位末端轉移酶標記法(TUNEL)染色異氟烷麻醉結束后6 h，每組隨機抽取6只轉APP基因小鼠，灌注固定后殺鼠取腦，石蠟包埋后，在視交叉后1～4 mm處切取10 μm的冠狀位腦片，每隔5片選一片，每只小鼠選用3張腦片，常規脫蠟水合后加入蛋白酶K，37℃孵育30 min，每個樣本加入50 μl TUNEL反應混合液(50 μl TdT+450 μl熒光素標記的dUTP)，陽性對照樣本加入100 μl DNase I反應液，陰性對照樣本中加入50 μl不含TdT酶的反應液，加入含HRP的熒光素抗體37℃孵育30 min，選用二氨基聯苯胺(DAB)顯色，蘇木素復染后，400倍顯微鏡下觀察凋亡細胞，鏡下出現細胞核呈桔紅色、胞質不著色、染色質呈塊狀凝聚或裂解成顆粒狀的細胞，即為陽性染色細胞。

1.3.4ELISA法檢測Aβ1～42含量麻醉結束后24 h將每組剩余6只轉APP基因小鼠處死，分離海馬組織，取一側海馬稱重后超聲粉碎10～15次，17 000 r/min，4℃離心1 h，取中間層含Aβ的組織液作為ELISA檢測的樣本，嚴格按照ELISA試劑盒說明書進行操作。

1.3.5Western印跡檢測Bcl-2、Bax、半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-3的表達取小鼠另一側海馬，加入細胞裂解液提取海馬總蛋白，BCA法測定總蛋白濃度，經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分離蛋白后轉移至PVDF膜，0.5%脫脂奶粉封閉2 h后加入Ⅰ抗，即兔抗鼠Bcl-2、Bax、Caspase-3多克隆抗體(1∶1 000)，孵育過夜，常規洗膜后與Ⅱ抗即HRP標記的山羊抗兔IgG抗體(1∶2 000)室溫反應1 h，洗膜后采用Image J軟件測定各條帶灰度值，以目的蛋白條帶灰度值與相應β-actin灰度值的比值作為Bcl-2、Bax、Caspase-3 蛋白的表達水平。

#0是規模最大的聚類，主要研究高端模擬教學試驗、多種教學法相結合、團隊合作學習在護理學基礎教學中的應用價值與應用效果以及病理學、臨床微生物學、藥學等學科的實驗教學體系的應用、改革與創新；#1主要研究循證護理、術后護理與術后健康教育、并發癥、術中護理安全及防范措施等；#2主要研究早期糖尿病腎病評估與診斷以及糖尿病腎病的臨床護理與治療；#3主要研究植物藥材揮發油的抗腫瘤作用及其化學成分的研究；#4主要研究軸掃技術在CT腹部檢查中的作用以及體層攝影術在臨床檢查、診斷中的應用價值。

2結果

2.1Morris水迷宮實驗

2.2.1定位航行試驗隨著訓練次數的增加，各組小鼠平均逃避潛伏期均呈逐漸縮短趨勢。第1天至第4天，Iso組平均逃避潛伏期〔(72.69±12.15)s〕與Control組〔(51.23±10.29)〕s相比明顯延長(P<0.01)；Iso+Tre組〔(55.06±12.35)s〕與Iso組相比逃避潛伏期縮短(P<0.05)；第5天3組小鼠逃避潛伏期均無明顯差異(P<0.05)。見圖1。

圖1　各組轉APP基因小鼠平均逃避潛伏期趨勢圖

2.1.2空間探索實驗Iso組空間探索時間〔(28.85±5.41)s〕比Control組〔(41.25±8.32)s〕明顯縮短(P<0.01)；Iso+Tre組〔(38.01±7.51)s〕與Iso組比較，空間探索時間明顯延長(P<0.01)；Iso+Tre組與Control組相比無明顯差異(P<0.05)。

2.2TUNEL染色結果海馬神經元凋亡指數(AI)=陽性細胞數/(陽性細胞數+陰性細胞數)×100 %。Iso組陽性細胞較多，細胞核呈橘紅色，胞質不著色，染色質呈塊狀凝聚或裂解成顆粒狀，使圓形核致密深染或見多個細小顆粒聚集，Iso組神經元凋亡指數(0.713%±0.041%)明顯高于Control組(0.159%±0.065%)(P<0.01)，Iso+Tre組神經元凋亡指數(0.287%±0.094%)比Iso組明顯降低(P<0.01)，但與對照組相比仍有差異(P<0.05)。見圖2。

圖2　各組小鼠海馬CA1區神經元凋亡

2.3ELISA檢測結果Iso組Aβ1～42含量〔(9 908.18±1 103.44)pmol/g腦組織〕明顯高于Control組〔(7 858.21±1 003.12)pmol/g腦組織〕(P<0.01)；Iso+Tre組〔(8 025.41±668.75)pmol/g腦組織〕與Iso組相比較，Aβ1～42含量明顯下降(P<0.01)，與Control組比較無明顯差異(P<0.05)。

2.4Western印跡檢測結果與Control組相比，Iso組小鼠海馬組織Caspase-3 、Bax基因表達顯著增強，Bax/Bcl-2比值升高，Bcl-2基因表達減少(P<0.01)；Iso+Tre組比Iso組小鼠海馬組織Caspase-3、Bax基因表達明顯減少，Bax/ Bcl-2比值降低，Bcl-2基因表達增加(P<0.01)，但與Control組相比仍有差異(P<0.01)。見表2，圖3。

組別Bcl-2BaxCaspase-3Bax/Bcl-2Control組1.141±0.2510.104±0.0230.152±0.0240.089±0.029Iso組0.325±0.0521)1.302±0.2111)1.125±0.2211)4.112±0.0241)Iso+Tre組0.711±0.1541)2)0.412±0.0531)2)0.534±0.0751)2)0.578±0.0221)2)

與Control組比較：1)P<0.01；與Iso組比較：2)P<0.01

圖3　各組小鼠海馬組織Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表達

3討論

轉APP基因小鼠是目前應用最廣泛的AD動物模型之一，其相關的病理改變與人類相似，過度表達突變的人類APP基因，導致Aβ1～42沉積、斑塊形成，9月齡即可表現出認知功能下降，可用于排除手術等環境因素的干擾，單獨討論麻醉對AD病理過程的影響〔4〕。

Morris水迷宮實驗是評估嚙齒類動物學習記憶能力的重要手段之一，考察實驗動物的空間定向和定位能力，對海馬結構受損尤其敏感。本實驗結果說明異氟烷能夠損害小鼠的學習記憶功能，這種損害的程度可能隨著時間推移減弱，提示異氟烷麻醉可能對轉APP基因小鼠的遠期認知功能有所影響；而麻醉前給予海藻糖能夠明顯縮短異氟烷麻醉后小鼠的逃避潛伏期，延長其空間探索時間，表明使用海藻糖干預能在短時間內阻止異氟烷誘導轉APP基因小鼠的學習記憶功能損害。

AD的病理改變包括老年斑形成、神經元纖維纏結、神經元減少等，細胞凋亡是引起神經元減少的重要原因。海馬結構在學習記憶過程中起至關重要的作用，也是AD患者最早、最易受損的部位，海馬神經元凋亡破壞了神經網絡系統的完整性，是AD發病的重要機制〔5〕。Bcl-2家族和Caspase在線粒體凋亡通路中具有重要意義。Bcl-2家族分為兩類，一類是抗凋亡基因，代表基因是Bcl-2基因；一類為促凋亡基因，代表基因為Bax基因〔6，7〕。Bcl-2蛋白能與Bax蛋白形成Bcl-2-Bax異源二聚體，抑制Bax的作用，保護細胞不進入凋亡程序，因此觀察Bcl-2與Bax的比值比二者的絕對量更有意義。常用吸入麻醉藥異氟烷具有潛在的神經毒性作用，有研究證實其通過對Bcl-2和Bax的差異性影響，導致Caspase-3的表達和活性改變，進而引起腦神經凋亡〔8〕。此外，Bcl-2家族蛋白能和線粒體膜上的其他孔蛋白相互作用，形成一個無選擇性的通透性轉換孔(PTP)。Zhang等〔9〕的研究發現，異氟烷能夠通過增加活性氧類物質的產生，誘導線粒體通透性轉換孔打開，導致線粒體被破壞，線粒體膜蛋白含量減少，降低ATP的水平，進一步引起Caspase家族激活以及細胞凋亡，最終產生學習和記憶功能的損害。

Aβ是老年斑的核心成分，最近有研究證實，在表現出明顯的認知功能障礙或癡呆癥狀之前的10～15年，即可發生Aβ蛋白水平升高、聚集和形成斑塊等一系列早期病理改變〔10〕。Aβ由APP經β分泌酶和γ分泌酶作用后生成，有Aβ1～40和Aβ1～42兩種形式，Aβ1～40含量較多，可見于正常老年人及AD患者；Aβ1～42主要見于AD患者腦中，更易于聚集，具有很強神經毒性〔11〕。Aβ1～42的異常聚集形成淀粉樣斑塊是各種原因誘發AD的共同通路，與Aβ1～40相比，患者腦脊液中Aβ1～42濃度的改變更能反映AD的嚴重程度〔12〕。Aβ寡聚體通過激活小膠質細胞，釋放補體、細胞因子、自由基等免疫分子，從而造成神經元功能損害〔13〕。此外，體外試驗證實，Aβ1～42能夠引起Bax/Bcl-2比值升高，決定細胞受誘導后更傾向于凋亡〔14〕。結果表明長時間吸入異氟烷麻醉使轉APP基因小鼠腦內Aβ1～42含量明顯升高，加速AD模型小鼠的神經退行性改變，這與Perucho等〔2〕的研究結果相類似。

海藻糖是一種安全的天然糖類，對生物分子具有特異性保護作用，目前未見與劑量相關的不良反應。本實驗結果表明，麻醉前給予海藻糖干預，能夠有效拮抗異氟烷引起的轉APP基因小鼠海馬結構的病理改變，作用于線粒體凋亡通路，抑制Bcl-2、Bax、Caspase-3的活化，減少神經元凋亡并能降低海馬Aβ的含量，從而有效改善轉APP基因小鼠的學習和記憶功能，為尋找更加安全有效的麻醉方案提供了實驗依據。

4參考文獻

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〔2013-12-02修回〕

(編輯袁左鳴)