沉默單酰基甘油脂肪酶mRNA對肝癌大鼠的作用及機制

沉默單酰基甘油脂肪酶mRNA對肝癌大鼠的作用及機制

王金龍張俊勇陳懿王曉波1龔建平

(重慶醫科大學附屬第二醫院肝膽外科，重慶400010)

摘要〔〕目的研究沉默單酰基甘油脂肪酶(MAGL)mRNA對大鼠肝癌的作用及其機制。方法CBRH7919大鼠肝癌細胞原位移植法建立大鼠肝癌模型，建模后免疫組化檢測肝癌組織及正常肝組織甲胎蛋白(AFP)表達。分為PBS液組；MAGL-shRNA質粒微泡組；空白微泡+超聲輻照組；MAGL-shRNA質粒微泡+超聲輻照組(A)；MAGL-shRNA質粒微泡+超聲輻照組(B)；MAGL-shRNA質粒微泡+超聲輻照組(C)。每只大鼠經尾靜脈注射1 ml相應試劑，并對空白微泡+超聲輻照組和MAGL-shRNA質粒微泡+超聲輻照A、B、C組的大鼠肝區給予超聲輻照。前4組：免疫印跡檢測大鼠肝癌組織MAGL表達，熒光定量PCR檢測MAGL mRNA表達情況,ELISA檢測癌組織游離脂肪酸(FFAs)。解剖并比較各組大鼠的腫瘤大小、轉移情況。B組給予高脂飲食1 w后與C組一同處死，比較其腫瘤組織MAGL表達情況、FFAs含量以及腫瘤大小。結果腫瘤病理檢測符合原發性肝癌。前四組：免疫印跡檢測顯示，MAGL-shRNA質粒微泡+超聲輻照組A的MAGL蛋白表達趨勢明顯降低；PCR結果顯示，該組MAGL-mRNA明顯低于其他3組 (P<0.05)；ELISA顯示該組FFAs含量明顯低于其余各組(P<0.05)；該組腫瘤平均大小及轉移率明顯小于其余三組 (P<0.05)。后兩組：高脂飲食組癌組織MAGL蛋白表達、FFAs濃度明顯高于正常飲食組，且前者腫瘤明顯大于后者(P<0.05)。結論沉默MAGL mRNA能夠明顯抑制大鼠肝癌生長；高脂飲食能夠逆轉MAGL沉默基因的治療作用；MAGL作用機制可能是通過調控FFAs及下游因子實現。

關鍵詞〔〕肝癌；單酰基甘油脂肪酶；超聲微泡

中圖分類號〔〕R73〔

基金項目：重慶市衛生局重點科研項目(2011-1-123)

通訊作者：龔建平(1961-)，男，博士，教授，主任醫師，主要從事肝膽外科學研究。

1重慶市涪陵中心醫院肝膽外科

第一作者：王金龍(1979-)，男，碩士，主治醫師，主要從事肝膽外科學研究。

現階段針對肝細胞癌的有效治療手段以手術和索拉菲尼等藥物化療為主。近年來的研究結果表明脂質代謝紊亂、肥胖等與肝細胞癌的發生密切相關〔1～4〕。單酰基甘油脂肪酶(MAGL)作為甘油三酯代謝的關鍵酶，可能通過調控游離脂肪酸(FFAs)的生成，并進一步影響FFAs的下游代謝產物，在侵襲性腫瘤的生長、侵襲中發揮重要作用〔5〕。FFAs的幾個代謝產物如前列腺素E2(PGE2)、溶血性磷脂酸(LPA)等已經在既往的研究中被證實在肝細胞癌的進展中起重要的促進作用〔6～11〕。本文通過超聲微泡靶向轉染技術，在大鼠肝癌組織局部轉染MAGL-shRNA，通過抑制大鼠肝癌組織MAGL的表達，觀察對大鼠肝細胞癌的生長、浸潤及轉移的影響，并初步探討其可能的機制。

1材料及方法

1.1動物及飼養健康裸小鼠5只，健康SPF級雄性SD大鼠40只，購自重慶醫科大學動物實驗中心并在該中心進行飼養。動物使用許可證號:CQLA-2011-2443。實驗遵循《重慶市實驗動物管理辦法》，并已取得重慶醫科大學倫理委員會批準。

1.2CBRH7919細胞培養及裸鼠皮下種植及傳代CBRH7919大鼠肝癌細胞株購自上海生命科學研究院。培養基采用含10%胎牛血清及青霉素、鏈霉素雙抗的1640培養基，在37℃含5%CO2的恒溫孵箱內培養。細胞懸液接種于裸小鼠肩胛部皮下。待其腫塊長大至直徑約1.0 cm時，麻醉荷瘤裸小鼠完整取出腫塊，取生長旺盛之魚肉樣組織切成小塊接種于另外一只裸小鼠肩胛皮下傳代培養。如此連續傳代培養3次后，得到生長旺盛的腫瘤組織，取其邊緣生長旺盛的魚肉樣組織切成1 mm3備用〔12～14〕。

1.3SD大鼠移植法原位肝癌模型構建在術前1 d，術后3 d分別給予地塞米松2 mg肌注，2次/d。使用苯巴比妥腹腔麻醉，常規消毒皮膚，取腹部正中切口打開腹腔并暴露肝臟。取肝中葉用眼科鑷斜行刺入建立一隧道，將準備好的瘤塊放入，使用棉簽壓迫止血，關閉腹腔，完成操作〔14〕。

1.4判斷建模成功麻醉下逐只打開大鼠腹腔觀察成瘤情況，發現有32只大鼠建模成功，局部有腫瘤生長，顯露的瘤體呈白色，包塊偏硬。處死大鼠,病理檢測符合原發性肝細胞癌特征。

1.5試驗用質粒制備及攜MAGL-shRNA超聲微泡合成制備好的MAGL-shRNA質粒購自美國Santa Cruz公司，使用紫外分光光度計調整質粒的濃度為1 g/L。按照文獻〔15〕的步驟制備超聲微泡并將其與質粒DNA進行表面連接，將其濃度調整為0.1 g/L。

1.6治療方法荷瘤大鼠30只隨機分為6組，PBS液組、MAGL-shRNA質粒微泡組(MAGL-shRNA+MB)、空白微泡+超聲輻照組(MB+US)、MAGL-shRNA質粒微泡+超聲輻照組A(MAGL-shRNA+MB+US A)、MAGL-shRNA質粒微泡+超聲輻照組B(MAGL-shRNA+MB+US B)、MAGL-shRNA質粒微泡+超聲輻照組C(MAGL-shRNA+MB+US C)。分別經尾靜脈注射入1 ml相應試劑。空白質粒微泡+超聲輻照組和MAGL-shRNA質粒微泡+超聲輻照組A,B,C注射后立即采用超聲輻照治療：頻率300 kHz，2 W/cm2，輻照時間為10 s，間隔10 s，總時間20 min〔15〕。3 w后處死前4組大鼠，對于MAGL-shRNA+MB+US B，C組則繼續飼養1 w：MAGL-shRNA+MB+US B改為給予高脂飲食飼養，MAGL-shRNA+MB+US C繼續給予常規飲食飼養，1 w后處死進行檢測。

1.7檢測指標及檢測方法轉染后3 w采用斷頸法處死前4組大鼠：(1)認真解剖大鼠，比較各組大鼠腫瘤大小及遠處轉移情況。(2)Western印跡檢測腫瘤組織MAGL蛋白的表達情況。收集大鼠肝癌組織并按照以下步驟進行操作：腫瘤組織勻漿蛋白的提取；檢測蛋白濃度；配制分離膠和電泳膠；電泳及轉膜；封閉及顯色。(3)Q-PCR檢測腫瘤組織MAGL mRNA表達情況。首先從收集的大鼠肝癌組織中提取總RNA，按照常規體系配置反應液去基因組。檢測總RNA純度及其完整性無誤，進行逆轉錄。最后進行定量PCR檢測，并在PCR儀及電腦上完成操作。(4)腫瘤組織病理學檢查，取出腫瘤組織用4%多聚甲醛溶液固定，石蠟切片；HE染色，觀察腫瘤組織的病理學分型；免疫2步法測定正常組織及肝癌組織甲胎蛋白(AFP)表達。(5)ELISA檢測各組大鼠FFAs含量。

對于后2組大鼠，則繼續飼養1 w處死：取腫瘤組織檢測MAGL在蛋白水平表達及FFAs濃度，比較2組腫瘤的平均大小，具體方法同上述。

2結果

2.1大鼠腫瘤病理學結果打開大鼠腹腔，可見灰白色腫塊位于大鼠肝臟表面，切開后腫瘤組織呈魚肉樣，其與周圍組織分界不清，無明顯包膜。HE染色后于鏡下觀察可見彌漫排列的腫瘤細胞，呈浸潤性生長，腫瘤細胞形態不規則，較多核分裂相，胞質豐滿，內有較多空泡。見圖1。

2.2免疫組化檢測結果檢查結果顯示大鼠肝細胞癌組織AFP表達明顯較正常肝組織高，其鏡下表現在細胞胞質內呈棕黃色或者棕褐色，彌漫分布，如圖2。

2.3Western印跡結果檢測顯示各組實驗大鼠肝癌組織在33 kD處都顯現特異性條帶；其中前4組比較，MAGL-shRNA+MB+US組A(4組)的MAGL蛋白表達趨勢明顯弱于其他各組；后兩組比較，高脂飲食組(5組)明顯較常規飲食組(6組)表達升高，見圖3。

圖1　大鼠肝癌HE染色鏡檢結果(×400)

圖2　正常與肝癌組織AFP表達(DAB)

1:PBS組， 2:MAGL-shRNA+MB組，3:MB+US組，4:MAGL-shRNA+MB+US組A,5:MAGL-shRNA+MB+US組B，6:MAGL-shRNA+MB+US組C 圖3　大鼠肝癌組織MAGL的Western印跡測定結果

2.4肝癌組織RT-PCR檢測結果MAGL-shRNA+MB+US組A(4組)較其余3組MAGL mRNA表達明顯降低(P<0.05)。

2.5癌組織FFAs檢測結果MAGL-shRNA+MB+US組A較其余三組FFAs濃度明顯降低(P<0.05)；高脂飲食組較常規飲食組明顯升高(P<0.05)。

2.6腫瘤大小及轉移情況MAGL-shRNA+MB+US A組腫塊平均大小(0.35 cm3)及轉移率(20%)較其余三組(PBS組0.80 cm3，80%；MAGL-shRNA+MB組0.78 cm3，100%；MB+US組0.82 cm3，80%)均明顯降低(P<0.05)，高脂飲食組腫瘤直徑(1.1 cm)明顯大于正常飲食組(0.6 cm)。

3討論

肝癌以我國的發病率最高，目前治療方案效果都不夠滿意，亟需在治療手段上取得突破。脂質代謝和基因治療是隨著醫學的發展出現的關于多種腫瘤治療的熱點并且取得了許多重要的進展；作為脂代謝的主要器官，目前認為肝癌的發生發展與脂代謝紊亂有明顯相關性。那么在肝癌方面，能否通過改變肝癌相關脂代謝的基因信息來有效治療肝癌成為我們一個亟需解決的問題。

近年來對于MAGL的研究取得了重要進展，研究者們發現作為甘油三酯代謝的一個關鍵酶不止在正常組織的能量代謝中起重要作用，而且可能在腫瘤組織中作為一個脂質代謝的調節中心通過促進FFAs及其下游脂質代謝產物的生成，從而促進腫瘤的增殖、浸潤和轉移，這已經在惡性黑色素瘤、乳腺癌、大腸癌等惡性腫瘤的研究中得到了證實〔5〕。本研究結果表明腫瘤組織FFAs的含量與MAGL呈正相關，這表明MAGL可能通過調節FFAs的生成進而影響FFAs的下游代謝產物中腫瘤信號因子的含量，調控肝癌細胞的增殖、浸潤及轉移。另外高脂飲食的攝入能夠逆轉基因沉默的治療效果，而其作用機制可能與MAGL及FFAs的再次升高有關。這也表明，高脂飲食有可能會促進肝癌的生長，為肝癌患者的飲食治療提供了可能的依據。

我們在試驗中用到的鼠類移植性肝癌模型，而在此前的試驗中我們采用過化學誘導建模，在建模成功后我們發現腫瘤彌散性生長，無法觀察其腫瘤生長情況，我們僅能通過比較腫瘤轉移率發現敲低該基因治療可能有效。因此我們再次采用大鼠肝癌細胞株原位移植法進行建模，建模成功后腫瘤單發生長且分泌AFP明顯增加，與臨床上肝癌的病理表現近似，是理想的肝癌研究動物模型〔16～21〕。

綜上所述，MAGL通過基因轉染并敲低了MAGL在肝癌組織的表達，腫瘤的生長及轉移率均呈明顯下降。這個發現為肝細胞癌的治療提供了一個可能的治療靶點。同時我們使用高質飲食逆轉MAGL基因沉默造成的治療效果以及對于癌組織FFAs測定的結果也為肝癌患者飲食治療及相關研究提供了可能的依據和機制。我們期待后續的試驗能夠更進一步，為臨床治療肝細胞癌打開一扇新的大門。

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〔2013-10-17修回〕

(編輯徐杰)