FTY720對乳腺癌MCF-7細胞增殖及Bax/Bcl-2基因表達的影響

FTY720對乳腺癌MCF-7細胞增殖及Bax/Bcl-2基因表達的影響

張淑芳方芳1李瓊書靳丹虹臺桂香

(長春醫學高等專科學校生化教研室,吉林長春130031)

摘要〔〕目的探討FTY720對人乳腺癌MCF-7細胞增殖及Bax/Bcl-2基因表達的影響。方法FTY720作用人乳腺癌細胞29 h，觀察細胞形態，應用Western印跡檢測細胞Bax/Bcl-2基因表達；FTY720作用人乳腺癌細胞48 h，應用四甲基偶氮唑藍(MTT)法檢測細胞增殖抑制率，通過流式細胞術(FCM)檢測細胞周期、凋亡率。結果鏡下可見FTY720作用組細胞生長不良；MTT法檢測到該細胞的增殖受到不同程度的抑制，當FTY720濃度為6 400 ng/ml時，體外培養MCF-7細胞抑制率為62.0%，抑制率呈濃度依賴性(P<0.05)；流式細胞術檢測分析顯示，FTY720可將該細胞周期阻滯于G1期，細胞凋亡率也較對照組明顯增加(P<0.05)；Western印跡法檢測分析顯示，實驗組細胞中Bax/Bcl-2蛋白表達水平比值均較對照組明顯增高(P<0.01)。結論一定濃度的FTY720可抑制人乳腺癌MCF-7細胞增殖，誘導其發生凋亡，激活細胞凋亡基因Bax、抑制原癌基因Bcl-2表達。

關鍵詞〔〕FTY720；人乳腺癌細胞(MCF-7)；凋亡；抗腫瘤作用

中圖分類號〔〕R737.9〔

基金項目：吉林省衛生廳科研項目(2011ZC016)；吉林省教育廳“十一五”科學技術研究項目資助課題(2010-465)

通訊作者：臺桂香(1964-)，女，教授，博士，主要從事腫瘤免疫研究。

1吉林醫藥學院免疫學教研室

第一作者：張淑芳(1973-)，女，教授，碩士，主要從事腫瘤免疫研究。

FTY720是由冬蟲夏草分離出的活性成分多球殼菌素(ISP-1)，經結構改造而成的化合物，它作為一種新型免疫抑制劑被研究。近些年有研究發現，FTY720對某些腫瘤細胞的生長有抑制作用，可誘導人胰腺癌Miopac2細胞、裸鼠人肝癌細胞系MHCC-97H、白血病細胞HL-60、K562等凋亡〔1～3〕，但就其誘導人乳腺癌MCF-7細胞凋亡及其機制的研究，國內未見報道。本文研究FTY720對人乳腺癌細胞的作用及其機制。

1材料與方法

1.1材料與試劑人乳腺癌(MCF-7)細胞本研究室保存。FTY720購自美國BioVision公司。四甲基偶氮唑藍(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)、碘化丙啶(PI)購于北京鼎國生物技術公司。RPMI 1640培養基、RIPA細胞裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒為碧云天生物技術有限公司產品。小牛血清為杭州四季青公司產品。鼠抗β-actin單克隆抗體、鼠抗人Bcl-2和Bax單克隆抗體為Santa Cruz公司產品。辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.2主要方法

1.2.1細胞培養取人乳腺癌MCF-7細胞用含10%小牛血清、100 U/ml 青霉素及100 U/ml 鏈霉素的RPMI1640培養液，37℃、5%CO2孵箱常規培養，24～48 h換液、傳代1次。

1.2.2藥物作用細胞收集對數生長期的MCF-7細胞，調細胞濃度至5×104個/ml，接種于培養瓶，于37℃、5%CO2培養箱內培養24 h后給藥。實驗設藥物處理組和陰性對照組：藥物處理組每孔加入FTY720溶液使其終濃度達到25.6 μg/ml，陰性對照組不加藥物，37 ℃、5%CO2培養箱培養29 h，倒置顯微鏡下觀察各組細胞，拍照。

1.2.3MTT法檢測細胞增殖抑制率收集對數生長期的MCF-7細胞，調細胞濃度至5×104個/ml，接種于96孔培養板，每孔加100 μl細胞懸液，置37 ℃、5%CO2培養箱內培養24 h后給藥。實驗設藥物處理組、陰性對照組和空白對照：藥物處理組每孔加入100 μl FTY720溶液使其終濃度分別達到400、800、1 600、3 200及6 400 ng/ml，陰性對照組不加藥物，空白對照組只加RPMI1640培養液，各濃度組均設3復孔，37 ℃、5%CO2培養箱培養48 h，每孔加入5 mg/ml MTT 10 μl ，繼續孵育4 h后，棄上清液，加入150 μl DMSO，輕輕振蕩10 min，用酶標儀于490 nm 波長處測吸光度(OD)值，求平均值，計算藥物對細胞生長增殖的抑制率。細胞生長抑制率=(1-藥物處理組OD值/陰性對照組OD值)×100%。

1.2.4流式細胞儀檢測細胞周期及凋亡取對數生長期細胞給藥，同時設陰性對照，FTY720終濃度分別為800、1 600、3 200 ng/ml，作用細胞48 h后收集細胞，調整細胞濃度為1×106個/ml。1 000 r/min，離心5 min，棄上清，PBS緩沖液洗滌2次，70%乙醇4 ℃固定過夜，以50 μg/ml的PI 37℃避光染色30 min，用流式細胞儀檢測細胞周期及凋亡。

1.2.5Western印跡法檢測Bax、Bcl-2基因表達取對數生長期MCF-7細胞，常規培養24 h后加入藥物FTY720， FTY720終濃度分別為1.6、3.2、6.4、12.8及25.6 μg/ml，同時設不加藥物的陰性對照組，繼續培養29 h，取各組細胞，分別(按試劑盒說明書操作)加入預冷的RIPA細胞裂解液冰上裂解細胞后，離心5 min，收上清液用BCA法測各組總蛋白含量。將電泳裝置固定好，配10%分離膠，灌膠。待分離膠凝后，注入4%濃縮膠。濃縮膠凝后，拔掉梳子，取各組蛋白30 μg加樣，進行電泳。將上述SDS-PAGE電泳分離后的蛋白轉移至硝酸纖維素膜上，經50 g/L脫脂奶粉封閉1 h，加鼠抗人Bcl-2和Bax(1∶400稀釋)單克隆抗體及鼠抗β-actin單克隆抗體(1∶2 000稀釋)，4℃孵育過夜，加辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG(1∶5 000稀釋)室溫孵育2 h，DAB顯色。膠片經掃描后獲得圖像，以目的條帶與內參照的光密度比值表示蛋白表達。

1.3統計學方法采用SPSS13.0軟件進行方差分析和t檢驗。

2結果

2.1細胞形態將對照組和藥物作用組細胞常規培養29 h，光學顯微鏡下可見：對照組細胞生長旺盛，呈多邊形貼壁生長，胞質飽滿，細胞輪廓清晰，折光性強；藥物作用組(FTY720 25.6 μg/ml)細胞生長不良，細胞變圓，大小不一，不貼壁，胞質較少，細胞內可見明顯顆粒，部分細胞結構不完整，呈碎片狀，折光性差(圖1)。

2.2細胞增殖抑制率MTT法檢測顯示，濃度為400、800、1 600、3 200、6 400 ng/ml的FTY720作用48 h后，對MCF-7細胞的增殖均有一定程度抑制作用，抑制率分別為12.2%、23.8%、26.9%、36.3%、62.0%，呈濃度依賴性。與400 ng/ml組，1 600 ng/ml和6 400 ng/ml抑制率有差異。

2.3細胞周期及凋亡檢測經流式細胞儀檢測分析顯示，與對照組相比，隨藥物濃度增加，實驗組處于G1期的細胞逐漸增多，S期細胞明顯減少(表1)，表明FTY720可將其細胞周期阻滯于G1期；細胞凋亡率也較對照組明顯增加(P<0.05)。

對照組　　　　　　　　　　藥物作用組 圖1　光學顯微鏡下MCF-7形態(×100)

2.4Bax、Bcl-2基因表達Western印跡結果顯示，與對照組相比，不同濃度FTY720作用各組MCF-7細胞的Bax蛋白豐度增加、灰度減小，Bcl-2蛋白豐度減小、灰度增加，說明FTY720作用各組MCF-7細胞的Bax蛋白表達水平均增加，而Bcl-2蛋白表達水平減少；Bax與Bcl-2蛋白表達水平比值均較對照組明顯增高(P<0.01)。3.2、6.4、12.8、25.6 μg/ml FTY-720對應的Bax/Bcl-2蛋白水平比值分別為2.12、2.426、2.05、2.185。

表1FTY-720對MCF-7細胞周期及凋亡的影響

分組G1期S期G2期凋亡率對照組57.5±0.02130.6±0.03111.9±0.0124.22±0.015800ng/ml60.8±0.01821.5±0.02617.7±0.0345.64±0.0091)1600ng/ml66.3±0.03220.3±0.01113.4±0.0135.46±0.0021)3200ng/ml67.2±0.02219.6±0.04213.2±0.0096.86±0.0121)

與對照組比較：1)P<0.05

3討論

FTY720是將傳統中藥冬蟲夏草抽提物中的成分ISP-1進行結構改造而成的新物質，因由日本的Fujita教授(Taito公司)和Yoshitomi藥品公司共同研制成功而得名〔4〕。目前，FTY720的抗腫瘤作用已引起研究者的關注。有實驗證實， FTY720能誘導HL-60、Jurkat、實體膀胱腫瘤細胞、人胰腺癌等多種腫瘤細胞系凋亡〔1～3〕。本研究表明FTY720可誘導MCF-7腫瘤發生凋亡，且這種作用存在劑量依賴性。為進一步驗證FTY720是否誘導MCF-7細胞發生凋亡，Bcl-2基因是原癌基因，其突出作用是抑制細胞凋亡。 Bax基因是一種促凋亡基因，上調Bax蛋白水平可以促進細胞凋亡。本研究結果顯示，一定濃度的FTY720不但可誘導MCF-7細胞發生凋亡，同時也說明其可激活細胞凋亡基因Bax、抑制原癌基因Bcl-2表達，這可能是FTY720抑制乳腺癌MCF-7細胞增殖、誘導其凋亡的機制之一。

張丹丹〔5〕研究發現：FTY720對人卵巢癌細胞系SKOV3的生長抑制具有劑量時間依賴性，其可誘導該細胞發生G1期阻滯而誘導該細胞發生凋亡。本研究結果說明FTY720誘導人卵巢癌細胞系SKOV3和人乳腺癌MCF-7細胞發生阻滯的細胞周期相同，均可通過將細胞阻滯于G1而誘導細胞發生凋亡。劉赟等〔6〕研究結果提示：FTY720對肝癌細胞HepG-2侵襲能力具有抑制作用，并隨FTY720濃度的升高侵襲能力逐漸下降，其機制之一可能是降低了肝癌細胞MMP-2、MMP-9的蛋白質及基因表達。張丹丹〔5〕研究結果顯示FTY720可能是通過激活內源性Caspase途徑而誘導SKOV3細胞發生凋亡。而本研究結果顯示FTY720可能是通過影響MCF-7細胞中Bax與Bcl-2基因表達而誘導該細胞發生凋亡。上述研究結果提示：FTY720可能是通過不同的機制誘導不同的腫瘤細胞系發生凋亡。

本研究提示FTY720可抑制人乳腺癌MCF-7細胞增殖，誘導其凋亡，激活促凋亡Bax基因表達、抑制原癌基因Bcl-2表達。但關于FTY720對MCF-7細胞的作用還需進一步研究。

4參考文獻

1王瑞，何景華.FTY720抑制人胰腺癌Miopac2細胞株增殖的研究〔J〕.天津醫科大學學報，2008；14(4)：445-7.

2肖江衛，王崇樹，魏壽江，等.FTY720抑制裸鼠人肝癌細胞系MHCC-97H移植瘤生長的實驗研究〔J〕.實用癌癥雜志，2010；25(2)：122-5.

3李登舉，張瑤珍，黃偉，等.新型免疫抑制劑FTY720誘導HL-60和K562細胞凋亡的作用機制〔J〕.中華血液學雜志，2003；24(12)：663-4.

4Fujita T,Inoue K,Yamamoto S,etal.A potent immunosupptessive activity found in Isaria sinclairii metabolite〔J〕.J Antibiot,1994;47(2):208.

5張丹丹.FTY720對人卵巢癌細胞系SKOV3誘導凋亡的研究〔J〕.黑龍江醫學，2010；20(10)：723-6.

6劉赟，臧世利，趙浩亮.FTY720對人類肝癌細胞HepG-2侵襲能力的影響〔J〕.腫瘤研究與臨床，2010；22(5):315-8.

〔2013-07-12修回〕

(編輯安冉冉/曹夢園)