電針對阿爾茨海默病大鼠海馬膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子及受體的影響

電針對阿爾茨海默病大鼠海馬膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子及受體的影響

劉忠錦張海燕1孫麗慧1郎尉雅1孫忠平

(齊齊哈爾醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院，黑龍江齊齊哈爾161006)

摘要〔〕目的探討電針對阿爾茨海默病(AD)大鼠海馬膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)及受體GFR- a1表達的影響。 方法通過Morris水迷宮篩選56只健康Wistar大鼠，隨機分為正常組、模型組、西藥組和電針組，每組14只。正常組常規(guī)飲水和飼料，不給予任何處理。其余三組大鼠均采用聚集態(tài)Aβ25～35所致AD模型，模型組造模后不給予任何處理。電針組施以電針雙腎俞、雙太溪、雙足三里、百會、大椎等穴位治療。西藥組采用鹽酸多奈哌齊灌胃，療程4 w。治療后各組大鼠灌注固定后取海馬，用免疫組化和RT-PCR檢測大鼠海馬GDNF及受體的表達。結(jié)果與正常組大鼠比較，模型組大鼠海馬GDNF及其受體GFR-a1陽性細胞表達降低明顯(P<0.05);與模型組比較，電針組和西藥組大鼠海馬GDNF、 GFR-a1陽性細胞及GDNF mRNA表達增加(P<0.05)。結(jié)論電針可能通過對AD大鼠海馬GDNF及其受體GFR-a1表達增強的影響，對神經(jīng)元起到保護作用。

關鍵詞〔〕電針；阿爾茨海默病；膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子

中圖分類號〔〕R245.97〔

基金項目：黑龍江省教育廳科學技術研究資助項目(No.12521652 )

通訊作者：張海燕(1979-)，女，副教授，碩士，主要從事中西醫(yī)結(jié)合防治老年癡呆的研究。

1齊齊哈爾醫(yī)學院組胚教研室

第一作者：劉忠錦(1980-)，男，碩士，主治醫(yī)師，主要從事中西醫(yī)結(jié)合治療老年癡呆的研究。

目前藥物治療阿爾茨海默病(AD)沒有得到顯著效果〔1，2〕，而且有很大的局限性。針刺具有疏通經(jīng)絡，促進氣血運行，醒腦開竅的功效〔3〕，對大腦的功能重組和代償起著重要作用。膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)是轉(zhuǎn)化生長因子β超家族的新成員，促進神經(jīng)元軸突的定向生長以及運動神經(jīng)元損傷修復和神經(jīng)再生等。本實驗通過觀察電針對AD大鼠海馬GDNF及受體(GFR-a1)表達的影響，探討電針改善AD學習記憶障礙的分子機制。

1材料與方法

1.1主要試劑和儀器鹽酸多奈哌齊(江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司，批號：H20030472)，β-淀粉樣蛋白(Aβ)25～35(Sigma公司)，大鼠抗GDNF單克隆抗體(Santa Cruz)，羊抗大鼠GFR-al多克隆抗體(R&D)，RNA抽提試劑盒TrizolReagent(Gibco)，RT-PCR試劑盒(TaKaRa)，GDNF分子引物序列:正義5′-GACTCCAATGTGCCCGAAGA-3′，反義5′-CCTACCTTGTCACTTGCTAGCC-3′，該引物產(chǎn)生426 bp的cDNA片段,β-actin分子引序列:正義5′-ATGCCATCCTGCGTCTGGACCTGGC-3′，反義5′-AGCATTTGCGGTGCACGATGGAGGG-3′，該引物產(chǎn)生200 bp的cDNA片段由北京三博生物科技有限公司合成，十二烷基硫酸鈉(SDS，上海生工生物工程公司)，焦碳酸二乙酯(DEPC，F(xiàn)luka公司)。 腦立體定位儀(NARISHIGESN-2型),Morris水迷宮(中國醫(yī)學科學院藥物研究所),電針儀(上海華誼G6805-1A型)，光學顯微鏡(Olympus BX51,日本)。

1.2動物選擇及分組清潔級健康4月齡雄性Wistar大鼠60只，體重200～220 g，由黑龍江中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供(批號：2011003)，室內(nèi)常溫下常規(guī)飼養(yǎng)，經(jīng)水迷宮測試，篩選出其中56只，隨機分為正常組、模型組、西藥組和電針組，正常組常規(guī)飲水和飼料，不給予任何處理。其余三組大鼠均采用聚集態(tài)Aβ25-35所致AD模型，模型組采用造模后不給予任何處理。電針組采用造模后施以電針雙腎俞、雙太溪、雙足三里、百會、大椎等穴治療，用 0.25×0.25 mm2華佗牌無菌毫針針刺，連接G6805-1A型電針儀，電壓為2 V，頻率為30 Hz，強度以肢體局部輕微顫動為適。西藥組采用鹽酸多奈哌齊灌胃，每日0.6 mg/kg，療程4 w。

1.3模型復制10%水合氯醛3 ml/kg使大鼠麻醉后，固定在腦立體定位儀上。消毒皮膚,剪毛，在頭部做正中矢狀切口，牙科鉆孔器鉆顱有突破感，坐標為腦表面下3.5 mm,前囟1.5 mm，矢狀縫左右旁開1.5 mm。在每側(cè)側(cè)腦室注射10%鏈脲霉素10 μl。用微量進樣器抽取2 μl Aβ25～35(用無菌生理鹽水將其稀釋成10 μg /pl)37℃孵育1 w，使其變?yōu)榫奂癄顟B(tài)。創(chuàng)口縫合飼養(yǎng)，3 d后重復注射，術后大鼠每天肌注青霉素4萬單位預防感染〔4〕。

1.4各組大鼠標本的制備各組大鼠治療4 w，麻醉后固定于鼠板上，行胸腹聯(lián)合切口，切斷肋骨、膈肌，暴露出心臟，在左心室插入灌注針頭，快速灌入生理鹽水500 ml沖出組織內(nèi)血液，剪開右心耳，沖洗到肝臟變白，然后注入4%多聚甲醛,當大鼠尾巴、四肢僵硬為達到效果，取腦分離海馬〔5〕。一側(cè)海馬保存至液氮罐內(nèi)，一側(cè)置于4%多聚甲醛中固定24 h，取海馬標本，冠狀切片，片厚4 μm，經(jīng)乙醇脫水、二甲苯透明、浸蠟及石蠟包埋，連續(xù)切片，進行貼片，將附貼好的切片置于恒溫箱內(nèi)干燥。

1.5免疫組織化學檢測GDNF和GFR-a1(SP法)石蠟切片脫蠟、水化后,磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次，微波修復抗原,每張切片加抗GDNF抗體或者GFR-a1抗體,4℃過夜，PBS沖洗3次，加入生物素標記的第二抗體室溫下孵育10 min，再加入鏈霉菌抗生物素一過氧化物酶溶液室溫下孵育10 min，PBS沖洗后加新鮮配制的二氨基聯(lián)苯胺(DAB)溶液5～10 min，常規(guī)脫水透明,中性樹膠封片。用Image-ProPlus分析軟件進行圖像分析,每組切片取10個視野測定積分吸光度,取平均值代表GDNF 和GFR-a1表達。

1.6RT-PCR測定測定大鼠海馬GDNF mRNA各組大鼠海馬組織PBS沖洗,勻漿后采用Trizol法獲得RNA，RT-PCR反應按試劑盒嚴格操作,PCR反應結(jié)束后，取5 μl PCR產(chǎn)物(內(nèi)標取2.5 μl)加2 μl(6倍)樣品緩沖液混勻后進行2%瓊脂糖凝膠電泳，100 V電泳30 min。瓊脂糖電泳凝膠條帶經(jīng)Bio-Rad Quantity one 4.4.0圖像分析系統(tǒng)采集電泳圖像，并進行半定量分析，結(jié)果用基因擴增條帶吸光度與內(nèi)參照β-actin光密度值的比值表示。

2結(jié)果

2.1治療后免疫組織化學檢測GDNF和GFR-a1的表達與正常組大鼠比較，模型組大鼠海馬GDNF和GFR-a1表達明顯下降(P<0.05);與模型組比較，電針組和西藥組表達明顯增加(P<0.05)。見表1。

組別GDNF表達陽性細胞數(shù)(個/高倍視野)GFR-a1表達陽性細胞數(shù)(個/高倍視野)正常組109.62±7.911)113.57±8.131)模型組67.54±7.3578.16±7.26西藥組91.27±6.731)97.98±7.151)電針組92.98±7.461)99.62±6.811)

與模型組比較：1)P<0.05

2.2治療后RT-PCR測定各組大鼠GDNF mRNA比較與正常組大鼠比較，模型組GDNF mRNA含量明顯降低(P<0.05);與模型組比較，電針組和西藥組含量明顯增加(P<0.05)。見圖1。

1 正常組，2 模型組，3 電針組，4 西藥組 圖1　RT-PCR測定各組大鼠GDNF mRNA的表達

3討論

神經(jīng)營養(yǎng)因子是一類對神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮神經(jīng)營養(yǎng)作用的非常規(guī)營養(yǎng)物質(zhì)〔6〕,1993年在小鼠膠質(zhì)細胞系B49中發(fā)現(xiàn)了GDNF，GDNF通過招募GDNF受體及其酪氨酸激酶蛋白形成復合物激活下游信號轉(zhuǎn)導途徑來實現(xiàn)生物學效應，GFR-a1與GDNF的親和性最強。星形膠質(zhì)細胞約占正常成人中樞神經(jīng)系統(tǒng)細胞總數(shù)的40%，研究發(fā)現(xiàn)星形膠質(zhì)細胞能釋放GDNF等大量的活性物質(zhì),對膽堿能神經(jīng)受損后具有保護作用，并能預防和延緩膽堿能神經(jīng)元的退行性病變〔7〕。

祖國醫(yī)學認為人到老年氣郁、氣虛,均可致血癖，而癖血入腦，精髓枯萎而癡呆。百會屬于督脈，針刺百會可以激發(fā)督脈及其他經(jīng)脈的經(jīng)氣，開竅醒腦，疏通腦絡淤滯，起到治療癡呆之功效。而太溪穴為補腎要穴，有調(diào)補腎氣之功，腎藏精、生髓，髓充精足則腦之神明得用。國內(nèi)外許多研究發(fā)現(xiàn)電針對于健忘和神智的恢復有較好的治療效果〔8，9〕。

本研究表明電針刺激AD大鼠海馬GDNF及其受體正向調(diào)節(jié)，進一步對受損神經(jīng)元起到保護和修復作用，所以AD大鼠癡呆癥狀得以改善。這可能是電針能有效防治老年性癡呆的作用機制。

4參考文獻

1Anitha M，Gondha C，Sutliff R，etal.GDNF rescues hyperglycemia-induced diabetic enteric neuropathy through activation of the PI3K/Akt pathway〔J〕.J Clin Inves，2006;116(2):344-56.

2Luis CA，Loewenstein DA， Acevedo A，etal.Mild cognitive impairment:directions of future research〔J〕.Neurology,2003;61(4):438-44.

3荊翔愚.針灸治療老年性癡呆進展〔J〕.河南中醫(yī)雜志，2010;30(4):415-7.

4Mansvelder HD,McGehee DS.Cellular and synaptic mechanisms of nicotine addiction〔J〕.J Neurobiol,2002;53(4):606-17.

5Wang XP,Ding HL.Alzheimer's disease: epidemiology,genetics,and beyond〔J〕. Neurosci Bull,2008;24(2):105-9.

6吳曉娟,魏明發(fā),柴成偉,等.膠質(zhì)細胞源神經(jīng)營養(yǎng)因子在大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞神經(jīng)分化中的表達〔J〕.實用兒科臨床雜志,2009;24(23): 1806-8.

7馬駿，王彥春，王述菊，等.電針對阿爾茨海默病模型大鼠海馬區(qū)神經(jīng)營養(yǎng)因子及其受體表達的影響〔J〕.針灸臨床雜志，2010;26(7):63-6.

8徐秋玲,劉濤.電針對老年癡呆癥大鼠海馬 CaMKⅡ表達的影響〔J〕.時珍國醫(yī)國藥,2013;24(1):236-8.

9楊曉航,劉智斌,牛文民,等.嗅三針對血管性癡呆大鼠學習記憶功能及海馬ChAT、 AchE活性的影響〔J〕.遼寧中醫(yī)藥大學學報,2010;12(7):40-2.

〔2013-07-11修回〕

(編輯袁左鳴)