鎂離子對 CCl4肝損傷小鼠腫瘤壞死因子－α和 Caspase－3含量的影響

鎂離子對CCl4肝損傷小鼠腫瘤壞死因子-α和Caspase-3含量的影響

孫設宗趙杰官守濤唐微劉興林

(湖北醫藥學院生化與免疫學實室，湖北十堰442000)

摘要〔〕目的研究鎂離子對四氯化碳(CCl4)致肝損傷小鼠腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和Caspase-3含量的影響。方法3月齡昆明種小鼠隨機分為模型組和對照組(常規飼料，飲自來水)；鎂離子低、中、高保護組(常規飼料，飲水中以MgSO4的形式分別加入10、20、40 mmol/L 的鎂離子)；飼養10 d，第11天對照組腹腔注射豆油溶液，其余各組腹腔注射0.15% CCl4豆油溶液，24 h 眼球取血，分離血清測丙氨酸轉氨酸(ALT)。處死小鼠，取出肝臟稱重,計算肝體指數，冰浴下制備肝勻漿，測定谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、一氧化氮合酶(NOS)活性及丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)、一氧化氮(NO)、TNF-α、Caspase-3的含量。結果CCl4肝損傷模型組小鼠肝體指數增大、MDA含量增加，ALT、 NOS活性增高；GSH含量減少，GSH-Px活性降低，NO、TNF-α、Caspase-3的含量增高；不同濃度的鎂離子保護組，能降低肝體指數、降低MDA含量和ALT、 NOS的活性；提高GSH含量，增加GSH-Px活性，降低NO、TNF-α、Caspase-3的含量(P<0.05，P<0.01)。結論鎂離子具有對抗和清除自由基作用，提高抗氧化酶活性，抑制TNF-α的分泌，降低Caspase-3的含量，對CCl4肝損傷有保護作用。

關鍵詞〔〕鎂離子；肝損傷；腫瘤壞死因子(TNF)-α；Caspase-3

中圖分類號〔〕R39〔

基金項目：湖北省教育廳科學技術研究項目(鄂教科〔2007〕4號B200724001)

通訊作者：唐微(1965-)，男，博士，教授，主要從事藥用蛋白基因工程研究。

第一作者：孫設宗(1954-)，男，高級實驗師，主要從事生化藥理研究。

各種原因的肝病發病機制雖不盡相同，但與自由基引發氧化應激、生物膜的脂質過氧化、腫瘤壞死因子α(TNF-α)異常分泌及Caspase-3激活密切相關〔1～4〕。鎂離子是生物體內第二大陽離子，是多種酶的輔酶。研究表明鎂離子具有良好的抗氧化作用，對肝損傷有保護作用，但其機制尚需進一步探討。本研究探討鎂離子對四氯化碳(CCl4)致肝損傷一氧化氮(NO)、TNF-α及Caspase-3含量的影響。

1材料與方法

1.1材料3月齡昆明種小鼠50只，雌雄各半體重32～36 g，由本院動物中心提供。丙二醛(MDA)、丙氨酸轉氨酶(ALT)、谷胱甘肽(GSH)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、一氧化氮合酶(NOS)、一氧化氮(NO)、TNF-α、Caspase-3檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所，其余為國產分析純生化試劑。ZS83- 1 型內切式組織勻漿機(浙西機械廠)，722S型分光光度計(上海第二光學儀器廠)，RA- 50 半自動生化分析儀(美國Technicon 公司)，酶標儀(上海第二光學儀器廠)。

1.2方法小鼠50只隨機分為五組，每組10只，模型組及對照組：常規飼料，飲自來水；鎂離子低、中、高保護組：常規飼料，飲水中以硫酸鎂(MgSO4)的形式分別加入10、 20、40 mmol/L 的鎂離子；飼養10 d，第11天對照組腹腔注射豆油溶液，其余各組腹腔注射0.15% CCl4豆油溶液(10 ml/kg),12 h后禁食不禁水， 24 h 眼球取血，分離血清，用速率法測ALT、處死小鼠，取出肝臟置冰生理鹽水中洗凈血液,用濾紙吸去水分稱重，計算肝體指數(肝重/體重)，用pH 7.4 的磷酸鹽緩沖液PBS 按1∶10稀釋冰浴下勻漿，4 000 r/min 離心5 min，取上清液用雙縮脲法測肝勻漿中蛋白質含量，用PBS 稀釋成4 mg/ml蛋白，按試劑盒要求測GSH-Px、NOS活性及MDA、GSH、NO、TNF-α、Caspase-3的含量。

1.3統計學方法采用SPSS13.0軟件進行方差分析。

2結果

2.1鎂離子對CCl4肝損傷小鼠肝體指數、ALT活性、MDA含量的影響模型組與對照組比較，肝體指數增大、MDA含量和ALT活性升高(P<0.01)，說明造模是成功的。不同濃度的鎂離子保護組能降低肝體指數、降低MDA含量和ALT活性，但降低MDA含量和ALT活性與鎂離子濃度成比關系，與模型組比較有統計學意義(P均<0.05)。見表1。

2.2鎂離子對CCl4肝損傷小鼠GSH含量及GSH-Px、NOS活性的影響與對照組比較，模型組GSH-Px活性下降、GSH含量降低、NOS活性升高(P均<0.05)；不同度的鎂離子能提高GSH-Px活性和GSH含量、降低NOS活性，與模型組比較有統計學意義(P﹤0.01)。見表2。

2.3鎂離子對CCl4肝損傷小鼠NO、TNF-α及Caspase-3含量的影響與對照組比較，模型組NO、TNF-α含量和Caspase-3活性明顯升高；不同濃度的鎂離子能降低NO、TNF-α含量和Caspase-3活性，與模型組比較有統計學意義(P均<0.05)。見表3。

組別肝體指數MDA(nmol/mg)ALT活性(U/L)模型組0.0505±0.00415.96±1.28234.77±31.68對照組0.0449±0.00812)4.05±1.682)29.81±11.022)鎂離子低劑量組0.048±0.00484.78±1.781)198.13±19.222)鎂離子中劑量組0.0474±0.00231)4.69±1.971)141.25±73.212)鎂離子高劑量組0.0453±0.00182)4.17±1.632)122.15±65.872)

與模型組比較：1)P<0.05，2)P<0.01，下表同

組別GSH-Px(U/mg)GSH(mg/g)NOS(U/mg)模型組579.65±14.1611.69±0.883.49±1.02對照組608.36±4.762)15.17±1.612)1.48±0.372)鎂離子低劑量組604.89±3.432)13.92±0.932)1.91±0.872)鎂離子中劑量組603.21±12.312)13.38±0.422)2.61±0.392)鎂離子高劑量組608.91±5.812)14.11±1.232)3.15±0.41

組別NO(nmol/ml)TNF-α(ng/ml)Caspase-3(μmol/L)模型組4.65±0.932133.76±17.3642.91±22.93對照組3.11±0.9262)107.62±13.872)6.78±3.8182)鎂離子低劑量組3.79±0.3261)94.61±7.672)14.23±6.7352)鎂離子中劑量組3.39±0.5922)110.27±8.812)18.95±15.812)鎂離子高劑量組3.82±1.271120.72±8.891)12.65±5.6352)

3討論

脂質過氧化代謝的終產物MDA，可直接激活Kupffer 細胞，使之分泌TNF-α等細胞因子；適量的TNF-α可調節機體的免疫功能，對維持機體的正常穩定狀態及抵御各種致病因子有著重要的作用。而TNF-α的異常分泌又可作為機體炎癥、損傷和休克的重要炎性介質，參與誘導細胞的凋亡過程〔5〕。TNF-α的作用主要有以下幾個方面：①TNF-α可激活肝星狀細胞進一步損傷肝細胞；② TNF-α可誘導NOS的基因表達增加NOS的活性，促進NO的合成；增加肝臟NO的含量，過量的NO能與氧自由基反應生成氧化性更強的超氧化亞硝基陰離子(ONOO-)進一步損傷肝細胞；另一方面NO 過高可直接抑制線粒體呼吸，使肝細胞內能量代謝障礙而引起肝細胞凋亡和壞死。③TNF-α能抑制線粒體融合蛋白基因2(Mfn2)表達,引起細胞線粒體損傷，抑制線粒體的呼吸功能并增加線粒體活性氧和過氧化脂質的形成〔6，7〕。本研究說明鎂離子抗CCL4肝損傷的機制與抑制TNF-α的分泌有關。

許多疾病都與細胞凋亡正、負向精確調控失誤有關，細胞過度凋亡或凋亡過度抑制時則引起疾病。各種原因的肝損傷、肝炎、肝腫瘤等疾病都與細胞凋亡存在著密切聯系〔8〕。Caspase-3正常情況下以酶原的形式存在，氧化應激時產生的TNF-α，內毒素、線粒體損傷均可激活Caspase-3從而導致細胞凋亡的發生，因此Caspase-3與急慢性肝損傷密切相關〔9〕。

綜上，鎂離子可通過對抗自由基的生成，降低肝體指數、MDA含量和ALT活性；增加GSH的含量和GSH-Px活性，抑制TNF-α的分泌、降低NOS活性和NO的含量，抑制Caspase-3的活性，對CCl4肝損傷有保護作用。鎂離子具有第二信使作用，但鎂離子抑制TNF-α的分泌和Caspase-3的活性的作用機制，是否也存在信號傳導途徑還需進一步探討。

4參考文獻

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〔2013-07-15修回〕

(編輯安冉冉/曹夢園)