黃芪多糖組分-A1對豚鼠自身免疫性腦脊髓炎的抑制作用

黃芪多糖組分-A1對豚鼠自身免疫性腦脊髓炎的抑制作用

郭喜霞賈梅1齊恒田2尹雅玲3潘國聘4趙繁榮4李鵬4

(新鄉醫學院第一附屬醫院，河南新鄉453003)

摘要〔〕目的探討黃芪多糖組分-A1(APS-A1)是對自身免疫性腦脊髓炎的抑制作用。方法用2.5、5、10 mg/kg 的APS-A1對自身免疫性腦脊髓炎豚鼠模型灌胃28 d。檢測神經功能評分，血清含量，血漿白細胞介素(IL)-1、IL-2、IL-6、IL-10的含量及血漿神經肽Y(NPY)、阿片受體β-內啡肽(β-EP)的含量，并對神經元進行形態學觀察。結果APS-A1劑量依賴性地抑制自身免疫性腦脊髓炎豚鼠神經功能評分下降、生化指標、神經遞質及形態學等各項指標的變化(P<0.05)。結論APS-A1具有抑制自身免疫性腦脊髓炎的作用。

關鍵詞〔〕黃芪多糖；自身免疫；腦脊髓炎

中圖分類號〔〕R733.7〔

基金項目：河南省科技廳科技攻關項目(132102310247)

通訊作者：李鵬(1980-)，男，副教授，碩士，主要從事天然藥物活性成分研究。

1濮陽市衛生學校2新鄉醫學院第三附屬醫院

3新鄉醫學院基礎醫學院4新鄉醫學院藥學院

第一作者：郭喜霞(1982-)，女，住院醫師，碩士，主要從事兒科學研究。

1材料與方法

1.1實驗動物英國種短毛豚鼠，雄性，清潔級，4周齡，體質量(200±20)g(河南省實驗動物中心提供，許可證號為SYXK-豫-005-0012)。動物房溫度控制范圍為18℃～22℃，環境潔凈度為500 000～8 000級，相對濕度控制范圍為40%～50%，換氣次數控制范圍為20次/h，氣流速度控制范圍為0.15～0.2 m/s，多級定向控制空氣壓差控制范圍為10～15%，自動定時器控制光照周期(7：30～19：00為光照期，19：00～07：30為黑暗期)，常規豚鼠飼料(河南省實驗動物中心提供，許可證號為SYXK-豫-005-0012)及二次凈化水飼養。

1.2藥品APS-A1(實驗室自備分離、純化)；醋酸潑尼松(武漢述元科技發展有限公司)。

1.3儀器及試劑Synergy H4全功能酶標儀(美國伯騰儀器有限公司)； FACScan 型流式細胞儀(美國 Becton-Dickinson公司)；IL-1、IL-2、IL-6、IL-10 ELISA 試劑盒(美國R-D公司)；神經肽Y(NPY) 放射免疫試劑盒(天津杰瑞公司)；阿片受體β-內啡肽(β-EP)放射免疫試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)；轉化生長因子(TGF)-β、基質金屬蛋白酶(MMP)-2、一氧化氮合酶(NOS)、CD3免疫組化試劑盒(長沙力康生物有限公司)。

1.4方法

1.4.1EAE豚鼠模型制備豚鼠氯胺酮麻醉(5 ml/kg，腹腔注射)，在無菌操作下，打開腹腔、胸腔，剪斷兩側肋骨，用鈍頭針從心尖略偏左進針至主動脈，生理鹽水灌注600 ml，4%多聚甲醛灌注固定。頭部沿枕骨大孔處剪斷，剝取腦和脊髓，去掉脊膜與馬尾，稱重，按照1∶3的質量比加入生理鹽水并制備成25%的豚鼠全脊髓勻漿。豚鼠全脊髓勻漿和完全弗氏佐劑以2∶1 比例充分乳化制備成穩定的豚鼠全脊髓勻漿抗原乳劑待用。豚鼠氯胺酮麻醉(5 ml/kg，腹腔注射)，將豚鼠全脊髓勻漿抗原乳(1 ml/kg)皮下注入豚鼠兩個后足墊皮內，同時左后肢足背皮下注射百日咳原漿液(2 ml/kg)，誘導 EAE 模型。免疫后每籠6只常規飼養。

1.4.2分組及處理豚鼠隨機分5組，6只/組。①正常對照組：后足墊皮內注射等量生理鹽水(1 ml/kg)；②EAE模型組：按照本實驗操作規定，注射豚鼠全脊髓勻漿抗原乳劑(1 ml/kg)；③ 醋酸潑尼松組：注射豚鼠全脊髓勻漿抗原乳劑(1 ml/kg)后當日灌胃醋酸潑尼松(2 ml·kg-1·d-1)；④ APS-A1低濃度組：注射豚鼠全脊髓勻漿抗原乳劑(1 ml/kg)后當日灌胃APS-A1(2.5 ml·kg-1·d-1)；⑤ APS-A1中濃度組：注射豚鼠全脊髓勻漿抗原乳劑(1 ml/kg)后當日灌胃APS-A1(5 ml·kg-1·d-1)；⑥ APS-A1高濃度組：注射豚鼠全脊髓勻漿抗原乳劑(1 ml/kg)后當日灌胃APS-A1(10 ml·kg-1·d-1)。第28天乙醚麻醉，指標檢測。

1.4.3EAE神經功能評分從建模當天起觀察每日發病情況，測體重1次/d，記錄發病潛伏期、癥狀持續時間、發病率及病死率，并進行神經功能評分。EAE神經功能評分：0分：無明顯異常；1分：尾部張力障礙；2分：后肢中度無力或麻痹；3分：后肢癱瘓，尿便失禁；4分：部分或完全前肢癱瘓；5分：瀕死或死亡。每天進行3次神經功能評分，取均值作為每只豚鼠每天的神經功能評分。

1.4.5酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測IL-1、IL-2、IL-6、IL-10按照ELISA試劑盒操作，450 nm單波長下，酶標儀讀取標準管及測試管OD值。

1.4.6放射免疫法檢測血漿NPY、β-EP的含量按照放射免疫試劑盒說明書要求操作，4℃冰箱過夜24 h，加入分離劑并充分混勻，室溫放置20 min，4℃恒溫3 000 r/min 離心20 min，棄去上清液。在γ計數儀上檢測血清NPY、β-EP的含量。

1.4.7免疫組化檢測腦組織TGF-β、MMP-2、NOS、CD3的含量按照免疫組化試劑盒說明書要求操作。200倍光鏡下，每張切片隨機選取5個視野，每個視野計數50個細胞，計數胞質呈棕黃色的陽性細胞。

1.4.8光鏡下觀察神經元形態豚鼠免疫后第28天乙醚麻醉，取出豚鼠腦，多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片(3～4 μm)，HE染色，光學顯微鏡下觀察。

1.4.9電鏡下觀察神經元形態豚鼠免疫后第28天乙醚麻醉，取出豚鼠腦3～4塊，每塊1 mm大小，制作電鏡切片，透射電鏡下觀察。

1.5統計學方法采用SPSS13.0統計軟件進行單因素方差分析及SNK-q多重比較分析。

2結果

2.1EAE豚鼠神經功能評分EAE組豚鼠神經功能評分最高為2.5分，豚鼠相繼出現進食減少、蜷縮少動、精神萎靡、皮毛干枯、大小便失禁、四肢無力及進行性全身癱瘓，部分豚鼠死亡；醋酸潑尼松組神經功能評分最高為0.45分，與同日EAE模型組比較有明顯差異(P<0.05)； APS-A1高濃度組神經功能評分最高為0.50分，與同日EAE模型組比較有明顯差異(P<0.05)。見圖1。

2.3血漿IL-1、IL-2、IL-6、IL-10的含量EAE模型組外周血IL-1、IL-2、IL-6、IL-10含量明顯升高；與EAE模型組比較，醋酸潑尼松與APS-A1高濃度組的IL-1、IL-2、IL-6、IL-10均有明顯差異(P<0.05)。見表2。

2.4血漿神經遞質NPY、β-EP的含量EAE模型組外周血神經遞質NPY、β-EP的含量明顯升高；醋酸潑尼松組與APS-A1高濃度組明顯抑制EAE豚鼠NPY、β-EP升高，與EAE模型組比較有明顯差異(P<0.05)。見表2。

組別CD+4細胞數CD+8細胞數CD+4/CD+8正常對照組43.65±1.682)3)25.76±1.562)3)1.66±0.272)3)EAE模型組53.76±2.651)18.65±0.871)2.86±0.361)醋酸潑尼松組45.54±1.561)2)3)24.64±2.061)2)3)1.97±0.231)2)3)APS-A1低濃度組51.44±2.041)3)18.64±2.141)3)2.86±0.291)3)APS-A1中濃度組44.46±2.111)2)23.33±1.751)2)2.44±0.261)2)APS-A1高濃度組46.94±1.441)2)3)25.89±1.682)3)1.95±0.361)2)3)

與正常對照組比較：1)P<0.05；與EAE模型組比較：2)P<0.05；與APS-A1中濃度組比較：3)P<0.05，下表同

2.5腦組織TGF-β、MMP-2、NOS、CD3 含量EAE模型組豚鼠腦組織TGF-β降低、MMP-2升高、NOS升高、CD3升高；醋酸潑尼松組與PAS-A1高濃度組明顯抑制豚鼠腦組織TGF-β降低、MMP-2升高、NOS升高、CD3升高，與EAE模型組比較有明顯差異(P<0.05)。見表3。

組別IL-1IL-2IL-6IL-10NPYβ-EP正常對照組1.78±0.352)3)6.65±1.062)3)3.76±0.352)3)633.76±32.652)3)398.34±21.732)3)316.78±23.842)3)EAE模型組4.97±0.671)3)12.76±1.671)3)7.84±1.071)3)1229.54±98.661)3)585.65±56.741)3)178.98±16.491)3)醋酸潑尼松組7.77±0.981)2)3)9.56±1.031)2)3)4.57±0.881)2)3)1045.77±87.761)2)3)417.69±23.681)2)3)329.15±30.221)2)3)APS-A1低濃度組5.98±0.641)3)9.36±0.851)3)7.87±0.651)3)1165.33±65.651)3)521.27±35.991)3)198.45±21.971)3)APS-A1中濃度組5.78±0.431)2)9.76±1.361)2)5.65±0.641)2)1176.69±89.951)2)497.89±29.681)245.58±32.721)APS-A1高濃度組8.76±0.841)2)3)11.55±1.271)2)3)4.84±0.961)2)3)1246.98±112.051)2)3)422.16±32.781)2)3)347.24±33.261)2)3)

組別TGF-βMMP-2NOSCD3正常對照組20.65±3.332)3)6.76±1.472)3)13.65±1.232)3)12.60±1.292)3)EAE模型組12.67±0.691)3)32.73±2.731)3)36.63±4.051)3)36.56±5.451)3)醋酸潑尼松組17.87±0.831)2)3)7.17±1.471)2)3)16.55±2.551)2)3)12.37±1.751)2)3)APS-A1低濃度組14.65±0.641)3)25.77±4.721)3)32.83±4.661)3)32.35±3.981)3)APS-A1中濃度組15.58±0.491)15.54±3.901)22.40±3.651)25.64±2.671)APS-A1高濃度組17.56±0.641)2)3)10.53±1.971)2)3)16.96±1.961)2)3)14.96±1.761)2)3)

圖1　各實驗組EAE神經功能評分

2.6光鏡下神經元形態EAE豚鼠大腦皮層神經元腫脹，并有炎細胞浸潤，部分神經元胞體變小或呈三角形，基質疏松伴明顯微空泡形成；醋酸潑尼松組和高濃度的APS-A1組明顯抑制神經元凋亡現象。見圖2。

A.正常對照組；B.EAE模型組；C.醋酸潑尼松組；D.APS-A1低濃度組；E.APS-A1中濃度組；F.APS-A1高濃度組 圖2　豚鼠大腦神經元光鏡圖像(HE，400×)

2.7電鏡下神經元形態EAE豚鼠大腦皮層神經元皺縮、膜結構不清；胞核固縮，染色質聚集成團、異染色質增多，高爾基體增多，線粒體腫脹，嵴融合并出現空泡變性。醋酸潑尼松和高濃度的APS-A1組明顯抑制神經元凋亡現象。見圖3。

A.正常對照組；B.EAE模型組；C.醋酸潑尼松組；D.APS-A1低濃度組；E.APS-A1中濃度組；F.APS-A1高濃度組 圖3　豚鼠大腦神經元電鏡圖像(8 000×)

3討論

EAE在兒童中的發病幾率較高，目前，糖皮質激素是治療EAE的常用藥物，具有抑制免疫應答、抗炎、抗毒、抗休克作用〔5〕。本研究結果顯示，APS-A1(10 g·kg-1·d-1)能夠推遲EAE發病時間，抑制EAE豚鼠神經功能下降，與醋酸潑尼松(2 g·kg-1·d-1)效果接近。

TGF-β對細胞的生長、分化和免疫功能都有重要的調節作用。活化的人MMP-2直接攻擊血管基底膜，引起炎細胞浸潤。NOS參與調節NO生成，NO是先天性免疫應答的調節性效應分子，作為一種信息傳遞物質維持正常的生理功能。CD3僅存在于T細胞表面，參與T細胞的信號轉導。本結果顯示，APS-A1(10 g·kg-1·d-1)抑制EAE豚鼠TGF-β、MMP-2、NOS、CD3的變化。APS-A1的作用與醋酸潑尼松類似，治療EAE前景較好，其具體的作用機制有待進一步研究。

4參考文獻

1Kwon HJ，Park YD.Determination of astragalin and astragaloside content in Radix Astragali using high-performance liquid chromatography coupled with pulsed amperometric detection〔J〕.J Chromatogr A，2011；12(16):1201-9.

2Kim MS，Kim SH.Inhibitory effect of astragalin on expression of lipopolysaccharide -induced inflammatory mediators through NF-κB in macrophages〔J〕.Arch Pharm Res，2011；34(12):2101-7.

3Kim GE，Kang HK，Seo ES,etal.Glucosylation of the flavonoid，astragalin by Leuconostoc mesenteroides B-512FMCM dextransucrase acceptor reactions and characterization of the products〔J〕.Enzyme Microb Technol,2012;50(1):50-6.

5Barnes D，Hughes RA，Morris RW,etal.Randomised trial of oral and intravenous methylprednisolone in acute relapses of multiple sclerosis〔J〕. Lancet，1997；349 (9056):902-6.

6Maimone D,Reder AT.Soluble CD8 levels in the CSF and serum of patient 25 with multiple sclerosis〔J〕.Neurology,1999;41(6):851-4.

7Panerai AE，Sacerdote P.Beta-endorphin in the immune system：a role at last〔J〕? Immunol Today,1997;18(7):317-9.

〔2012-12-20修回〕

(編輯安冉冉/曹夢園)