蒙藥嘎日迪－13味丸對腦缺血大鼠海馬組織白介素－1β、腫瘤壞死因子－α蛋白及神經細胞凋亡的影響

蒙藥嘎日迪-13味丸對腦缺血大鼠海馬組織白介素-1β、腫瘤壞死因子-α蛋白及神經細胞凋亡的影響

陶春林琳宋葆華湯文莉寶魯爾宣麗穎翟景波劉鑫張冬麗霍萬學劉月英

(內蒙古民族大學，內蒙古通遼028000)

摘要〔〕目的探討蒙藥嘎日迪-13味丸對腦缺血大鼠海馬組織炎性細胞因子白介素-1β(IL-1β)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)表達及神經細胞凋亡的影響。方法采用枕大池二次注血法至大鼠腦組織缺血損傷模型，在各時間段斷頭取腦，用ELISA法和流式細胞儀分別檢測腦缺血海馬組織中IL-1β和TNF-α的含量及細胞凋亡數量的百分比。結果與正常組比較，模型組海馬組織中IL-1β和TNF-α升高，細胞凋亡百分比增多(P<0.05)；與模型組比較，嘎日迪-13味丸組大鼠海馬組織中IL-1β和TNF-α含量降低，細胞凋亡百分比數減少(P<0.05)。結論嘎日迪-13味丸能降低大鼠腦缺血組織神經細胞凋亡數量，減輕缺血損傷程度，其機制可能與降低腦組織內IL-1β和TNF-α含量有關。

關鍵詞〔〕嘎日迪-13味丸；腦缺血；細胞凋亡；炎性因子

中圖分類號〔〕R743；R285〔

基金項目：內蒙古自治區教育廳研究項目(NJZY11204)；內蒙古自然科學

Effect of Mongolian medicine Garidi-13 pill on IL-1β, TNF-αprotein and nerve cell apoptosis of cerebral ischemia hippocampus tissue of rats

TAO Chun, LIN Lin, SONG Bao-Hua,etal.

Inner Mongolia University for the Nationalities, Tongliao 028000, Inner Mongolia, China

Abstract【】ObjectiveTo investigate the effects of Mongolian medicine Garidi-13 pill on inflammatory cytokines interleukin-1β(IL-β) and tumor necrosis factor-α(TNF-α) expression and nerve cell apoptosis of cerebral ischemia hippocampus tissue of rats. MethodsTwo times of blood injection to the cistema magna was used to make the rat model of cerebral ischemia. Brain tissue was acquired at each time point. Flow cytometry and ELISA were used to detect the number of apoptotic cells, IL-1β and TNF-α content in hippocampus tissue. ResultsCompared with normal group, IL-1βand TNF-αin hippocampus were increased, apoptosis percentage number was increased of model group (P<0.05). ConclusionsGaridi-13 can reduce the number of apoptosis nerve cell in ischemia brain tissue and reduce the severity of ischemic injury, its mechanism may be related to reduce IL-1β and TNF-αcontent of brain.

【Key words】Garidi -13 pill; Cerebral ischemia; Cell apoptosis; Inflammatory factor

第一作者：陶春(1960-)，男，教授，碩士生導師，主要從事神經病理學研究。

嘎日迪-13味丸(又名扎沖十三味丸)是蒙醫臨床常用的傳統方劑之一，由訶子、制草烏、石菖蒲、木香、麝香、珊瑚(制)、珍珠(制)、丁香、沉香、禹糧土、磁石(煅)、甘草、肉豆蔻 13 味藥組成〔1〕。在蒙醫臨床上一直用于腦缺血性疾病的治療(腦缺血性疾病在蒙醫學中稱之為“薩病”、“白脈病”)，主治半身不遂，左癱右瘓，口眼歪斜，四肢麻木，腰腿不利，言語不清，筋骨疼痛，神經麻痹等癥，臨床療效滿意〔2〕。但該藥作用機理研究尚少，臨床應用嚴重受限。為明確其抗腦損傷的作用及其機制，本實驗采用Elisa法和流式細胞儀分別檢測腦缺血大鼠海馬組織中IL-1β和TNF-α表達的變化及細胞凋亡數量的百分比。探討嘎日迪-13味丸對腦缺血損傷的抗炎作用，為其治療腦缺血損傷提供一定的實驗依據。

1材料與方法

1.1動物與分組清潔級SD大鼠72只，體重180～210 g，雌雄不拘，由吉林大學實驗動物中心提供，許可證號吉2007-0003，動物分籠飼養(環境溫度24～26℃，濕度60%～70%)，自由飲水，術前12 h禁食。將大鼠隨機分為3組，即正常對照組、模型組、嘎日迪-13味丸組，各組根據術后處死時間不同再分為模型1、3、5、7 d組和嘎日迪-13味丸1、3、5、7 d組，每組各8只大鼠。

1.2試劑與儀器美國DB公司生產BD Calibur流式細胞儀。芬蘭雷勃公司生產的MK3酶標儀，Elisa試劑盒購自美國GBD公司提供。嘎日迪-13味丸由內蒙古民族大學附屬醫院提供。水合氯醛為天津市河北區海晶精細化工廠產品。Annexin V fitc/pi細胞雙染試劑盒購自上海貝博生物試劑公司。

1.3方法

1.3.1給藥方法嘎日迪-13味丸丸以蒸餾水配制成2%濃度，經灌胃給藥，每日一次，每次1.2 ml。模型組均給予蒸餾水。正常對照組在同一環境下飼養。

1.3.2模型建立10%水合氯醛(0.35/100 g)腹腔注射麻醉后，大鼠俯臥位固定于操作臺上，項部備皮，安爾碘常規消毒。在左右耳根連線中點，沿正中線縱行切開頸部皮膚，暴露枕骨、環椎及環枕膜，用1 ml注射器針頭刺破環枕膜并稍稍推進到達枕大池，有腦脊液流出后，由左眼球后靜脈叢抽取0.3 ml無抗凝自體血，以0.1 ml/min注射速度緩慢將0.15 ml/100 g(體重)的自體不抗凝血注入枕大池。明膠海綿壓迫穿刺點3 min后縫合切口。將大鼠頭低30°俯臥位30 min，以利血液凝固沉積在腦底血管周圍。大鼠保溫復蘇至清醒后自由飲食飲水。48 h后同法操作制成大鼠腦梗死模型。嘎日迪-13味丸組在手術第二天開始給嘎日迪-13味丸灌胃。在第2次注射后第1，3、5、7天取腦待檢。

1.3.3模型成功標志大鼠蘇醒后按Longa5分制標準進行神經功能缺失評分〔3〕。0分：無明顯神經損傷癥狀；1分：不能完全伸展對側前爪；2分：行走時向對側旋轉；3分：行走時向對側傾倒；4分：不能自發行走，意識喪失。在1～3分者為有效模型。觀察期內沒入選及死亡的大鼠予以剔除，剩余每組6只。

1.3.4標本采集在第2次注血后分別在第1、3、5、7天斷頭處死各組大鼠，取腦海馬組織。手術在冰盒上進行。

1.3.5大鼠腦海馬組織IL-1β、TNF-α蛋白檢測采用ELISA法檢測IL-1β、TNF-α蛋白，方法嚴格按照說明書進行。

1.3.6大鼠腦海馬組織細胞凋亡百分率檢測將大鼠腦海馬組織標本置于生理鹽水中，充分吸收水分后，將組織剪切成2～3 mm直徑的小塊，放在單細胞制備儀中，加1 ml生理鹽水，研磨5 min左右。吸取組織液用10 000目細胞篩過濾后，用含0.1%牛血清白蛋白的PBS低速1 000 r/min離心5 min，洗滌2次，棄上清。根據試劑盒重懸細胞并標記細胞，嚴格按照說明書，上機檢測。

1.4統計學方法應用SPSS17.0統計分析軟件進行方差分析和t檢驗。

2結果

2.1各組大鼠腦海馬組織IL-1β和TNF-α蛋白水平與正常組〔IL-1β(18.01±1.86)、TNF-α(11.59±1.91)〕比較，模型組腦海馬組織IL-1β和TNF-α蛋白表達量較多，且隨著損傷時間延長，給予嘎日迪-13味丸治療后，TNF-α和IL-1β表達均不同程度的減少(P<0.05)，表明嘎日迪-13味丸能夠抑制腦缺血海馬組織炎性細胞因子TNF-α和IL-1β的表達。見表1，表2。

時間點模型組嘎日迪-13味丸組1d組41.17±3.931)24.93±5.643)3d組42.99±3.401)2)27.26±3.312)3)5d組60.41±4.621)2)26.14±4.392)3)7d組97.95±13.891)2)26.22±10.352)3)

與正常組比較：1)P<0.05；與同組前一時點比較：2)P<0.05；與同時點模型組比較：3)P<0.05，下表同

時間點模型組嘎日迪-13味丸組1d組27.49±4.431)28.26±1.903)3d組51.82±2.941)2)16.57±22.012)3)5d組64.81±3.781)2)21.88±4.712)3)7d組63.22±4.521)2)21.19±2.152)3)

2.2各組大鼠腦海馬組織細胞凋亡百分比比較與正常組比較(2.83±0.15)%，模型組大鼠腦海馬組織神經細胞凋亡百分比顯著增加(P<0.05)，且隨損時間延長細胞凋亡率增多，給予嘎日迪-13味丸治療后，凋亡細胞百分比降低(P<0.05)，見表3。

時間點模型組嘎日迪-13味丸組1d組3.75±0.341)1.86±0.213)3d組9.85±2.571)2)3.70±0.962)3)5d組5.20±0.861)2)2.95±0.262)3)7d組17.63±2.631)2)5.77±0.622)3)

3討論

腦缺血性疾病導致的腦缺血損傷，是非常復雜的病理生理過程，其與損傷級聯反應有關，具體包括興奮性毒性、周圍去極化、炎癥、程序性細胞死亡等四種主要機制，這四種機制往往是相互因果相互影響，其中細胞凋亡是腦缺血神經元損傷的嚴重結果〔4〕。盡管不同的機制參與了腦缺血損傷的病理過程，越來越多的證據表明，炎癥反應是其病理發展的重要因素。

炎癥是由級聯反應產生的大量細胞毒性成分誘導的細胞因子和致炎癥酶原產生的結果，細胞因子作用于內皮細胞受體，吸引白細胞并誘導它們移至腦組織造成損傷，細胞因子也可直接激活小膠質細胞產生有害介質〔5〕，所以有研究表明，抑制炎癥反應可能也是新的治療缺血性腦血管病的對策。

腦缺血性損傷首先影響的是細胞的能量代謝，ATP下降，各種依賴ATP的酶活性下降，能量代謝的異常產生了氧自由基(ROS)和鈣超載，鈣離子大量進入細胞內，損傷線粒體，這二個因素和一些炎癥介質共同協調作用，造成組織發生的級聯反應，細胞因子在其中扮演著重要角色，氧自由基和其他信使激活炎性細胞因子，導致小膠質細胞激活，產生炎癥反應。炎癥本身又產生自由基，導致惡性循環，進而引起細胞凋亡〔6〕。由上可知，腦缺血后激發的炎癥反應是腦組織損傷的關鍵，在炎癥級聯反應中，腫瘤壞死因子(TNF)-α、白介素(IL-1β)等炎性細胞因子的作用對腦缺血損傷有重要意義。

TNF-α在正常腦內有低水平表達，研究顯示，TNF-α屬于前炎癥因子，具有多效促炎性及神經毒性作用，是炎癥反應的起始因子。腦缺血誘發內皮細胞、星形膠質細胞和小膠質細胞產生TNF-α，使腦組織內TNF-α表達大量增加，TNF-α促進白細胞和內皮細胞黏附，并激活巨噬細胞、神經膠質細胞釋放炎性遞質，導致白細胞游走至受損腦組織引發炎性反應，使毛細血管周圍水腫和白細胞黏附毛細血管，并且TNF-α可經內皮細胞激活作用，促成凝血狀態和血管收縮，增加神經缺損和組織損傷。TNF-α還對毛細血管有直接毒性作用，導致毛細血管通透性增加和血-腦脊液屏障(BBB)破壞，加重白細胞浸潤及腦水腫。腦組織缺血后，活化的星形細胞、少突膠質細胞及浸潤的巨噬細胞分泌IL-1β，IL-1β介導小膠質細胞釋放細胞因子，促進內皮細胞表達黏附分子，刺激單核-巨噬細胞產生TNF-α，從而加重局部炎癥反應。IL-1β還可促進白細胞在炎性部位的聚集，并激活中性粒細胞使之參與炎癥的發展，通過破壞BBB，加重腦水腫〔7〕。以上最終導致了缺血核心區域不可逆性地損傷，然而，有研究表明，缺血核心壞死區和正常組織之間包圍著缺血半暗帶區，該區細胞結構存在但功能受損，細胞凋亡是細胞的重要形式，細胞凋亡是細胞基因調控下逐步走向死亡的過程，它是一種生理性死亡，不同于壞死，凋亡是腦損傷的動態進行過程，因此半暗區不是靜止的，隨時間推移和治療適宜，其大小也發生改變，梗死區可擴展到半暗區，如果及時或適宜的治療可縮小半暗區的范圍，這給了治療腦缺血疾病一個時間〔8〕，因此一直被國內外醫務工作和研究人員關注。有效抑制細胞凋亡，對腦缺血損傷的保護顯得至關重要。

本實驗結果表明，嘎日迪-13味丸能降低大鼠腦缺血組織神經細胞凋亡數量，減輕缺血損傷程度，其機制可能與降低腦組織內IL-1β和TNF-α含量有關。

4參考文獻

1國家藥典委員會.中國藥典〔S〕.北京：化學工業出版社，2005：190.

2林琳，陶春，湯文麗，等.扎沖十三味丸的藥理與臨床研究概況〔J〕.內蒙古民族大學學報(自然科學版)，2010；25(1)： 80-2.

3Zea Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，etal.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats〔J〕.Stroke，1989；20(1)：84-91.

4劉秀平，許棟明，王文，等.炎癥反應影響腦缺血再灌注損傷的研究進展〔J〕.中國康復理論與實踐，2009；15(11)：1041-3.

5倪光夏，石學敏，王占奎.針刺對缺血再灌注大鼠腦組織炎癥反應相關蛋白表達的影響〔J〕.江蘇中醫藥，2012；44(12)：73-4.

6劉劍剛，姚明江，黃志斌，等.還腦益聰方對老年大鼠腦組織炎癥因子及海馬核因子NF-κB表達的影響〔J〕.中華中醫藥雜志(原中國醫藥學報)，2011；26(1)：156-60.

7宋兆晶，吉訓明，牛小媛，等.腦缺血后炎性反應機制的研究進展〔J〕.中國腦血管病雜志，2010；7(3)：154-6.

8張金華，閆福嶺.腦梗死大鼠外周血促炎/抗炎細胞因子的動態變化〔J〕.中華腦血管病雜志(電子版)，2010；4(2)：88-93.

〔2013-06-11修回〕

(編輯曹夢園)