丙型肝炎病毒1a、1b 和2a 型 E1E2原核質粒的構建和序列分析

丙型肝炎病毒1a、1b和2a型E1E2原核質粒的構建和序列分析

胥冰黃峰霍慧春1

(陜西中醫學院醫學技術系免疫及檢驗教研室，陜西咸陽712046)

摘要〔〕目的構建陜西地方株丙型肝炎病毒(HCV)1a、1b和2a型包膜糖蛋白E1E2的原核質粒并測序比對。方法采用逆轉錄-巢式聚合酶鏈反應(RT- nest PCR)擴增獲得HCV 1a、1b和2a型E1E2片段，與pMD-18 simple vector連接，轉化感受態細菌DH5α，小量提取質粒DNA并測序。測序結果與Gene bank中其他標準序列比對以獲取同源性數據。同時重點分析E2蛋白高變區(HVR)1和2氨基酸序列。MEGA 4軟件繪制種系進化樹圖。結果成功擴增約2 kb的目的片段并構建原核質粒，測序結果正確。1b亞型E1E2的核苷酸和氨基酸序列的同源性最差。HCV E2的HVR1和2的序列比對顯示，同種基因亞型在HVR 1的變異性最大，而HVR 2的序列變異性不顯著。不同基因亞型的毒株在HVR 1和2的變異性極大，而1b亞型在HVR 1和2的變異性比1a和2a型突出。結論陜西地方株HCV 1b型E1E2區比1a和2a型更易發生突變，1b型E2的HVR變異性更顯著。

關鍵詞〔〕丙型肝炎病毒；包膜糖蛋白；基因型；序列分析

中圖分類號〔〕R512.6〔

基金項目：陜西科學技術廳自然科學研究項目資助(No.SJ08C232)

1陜西綏德名州鎮衛生院

第一作者：胥冰(1968-)，女，碩士，副教授，主要從事中醫藥免疫學研究。

丙型肝炎主要是由丙型肝炎病毒(HCV)經血液傳播引起的一種疾病，丙型肝炎所致肝硬化和肝癌以老年患者居多〔1〕。HCV為單股正鏈RNA病毒，基因組全長約9.6 kb。由于HCV所依賴的RNA聚合酶缺乏校正功能，導致基因組在序列上表現出極大的異質性，因此，依據序列同源性的差異，可將HCV區分為6種主要的基因型和不同的亞型。各種基因型和亞型的分布存在一定的地域差異，在我國以1型和2型為主〔2〕。在HCV基因組中，以包膜糖蛋白E1E2區的變異度最大，而E1E2在病毒吸附宿主細胞和保護性免疫方面具有重要作用〔3〕。本研究對陜西省HCV 1a、1b和2a型毒株的E1E2區進行RT-PCR擴增并構建原核質粒，將E1E2測序結果與已發表的毒株進行同源性比對分析。

1材料與方法

1.1質粒、菌種和主要試劑DH5a感受態細菌由本校生化教研室制備。AMV逆轉錄試劑盒(Promega公司)。LA Taq DNA聚合酶、pMD18-T Simple Vector和DNA Marker(Takara公司)。DNA凝膠純化和質粒小量提取試劑盒(Axygen公司)。

1.2血標本三份HCV血清取自陜西中醫學院附屬醫院丙型肝炎患者，均為男性，年齡63～71歲。

1.3方法

1.3.1HCV RNA提取和cDNA合成采用異硫氰酸胍-酚-氯仿法從血清樣本中提取HCV RNA，全部RNA溶于10 μl DEPC水中。按照AMV逆轉錄試劑盒說明書，加入隨機引物及AMV逆轉錄酶于42 ℃水浴中逆轉錄60 min，逆轉錄產物cDNA保存于-20℃。

1.3.2HCV E1E2的引物及PCR擴增以Gene Bank中HCV H77(1a)、HCV-J(1b)和JFH1(2a)株序列為模板，參照文獻設計擴增E1E2 基因序列的引物，見表1。引物均由上海生物工程公司合成。

采用巢式PCR法，按照LA Taq DNA聚合酶說明書進行操作。將4 μl cDNA加入PCR體系(LA Taq酶、DEPC水中，加入正向和反向的外引物共50 μl，第一輪PCR反應程序為95℃ 4 min；94℃ 30 s，52℃ 30 s，72℃ 3 min，35循環；72℃延伸10 min。取第一輪PCR產物5 μl加入50 μl體系中，加正向和反向的內引物進行第二輪PCR，反應程序為：95 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，35循環；72 ℃延伸10 min。擴增終產物取3 μl于1%瓊脂糖凝膠電泳，紫外成像儀觀察結果。

1.3.3原核質粒的構建凝膠純化HCV E1E2目的條帶，與pMD18-T Simple Vector進行TA克隆連接，轉化DH5a感受態細菌，涂布Amp + LB 平板中，37 ℃孵育過夜，挑取陽性克隆，擴增后小量提取并純化質粒。純化后的質粒DNA送上海生物工程公司測序鑒定。

1.3.4序列比對和進化樹分析將所獲得HCV1a、1b、2a型 E1E2的核苷酸序列及氨基酸序列分別與已報道的1a：H77(AF009606)、HC-J1(D10749)；1b：HCV-J(D90208)、HC-C2(D10934)；2a：JFH1(AB047639)、HC-J6(D00944)的E1E2序列進行同源性比較。并且利用MEGA 4軟件繪制種系進化樹。

表1HCV E1E2引物的序列及位置

引物極性位置(nt)序列(5'-3')1)長度1a外引物S1-1/A1-1+/-42～61/2670～2689CCCCTGTGAGGAACTACTGTACCCACCTACCCTTCAGATA2648bp內引物S1-2/A1-2+/-597～614/2641～2659TATGGCAATGAGGGTTGCCAGAAGAACACGAGGAAGG2063bp1b外引物S2-1/A2-1+/-74～92/2658～2676TGGCGTTAGTATGAGTGTTCCAGCCTGCCTTTGATGTA2603bp內引物S2-2/A2-2+/-585～603/2631～2649TATGGCAACGAGGGTATGGCGCAGAAGAACACGAGGAA2065bp2a外引物S3-1/A3-1+/-85/2770～2786TGGCGTTAGTATGAGTGTCGGCGTCATAAGCATAAGCC2703bp內引物S3-2/A3-2+/+721～739/2770～2786CCGACCTCATGGGGTACATGCGTCATAAGCATAAGCC2056bp

1)引物位置參考標準株：1a：HCV H77株；1b：HCV J株；2a：JFH1株

2結果

2.1逆轉錄-聚合酶鏈反應結果HCV1a、1b和2a亞型E1E2區段的RT-PCR產物全長約為2 kb，圖1為擴增產物的電泳圖，條帶清晰，大小符合預期。

M:250 bp DNA分子量標準；N：陰性對照；WXR-1a、LSG-1b和ZKX-2a為不同HCV基因型標本的陽性結果 圖1　HCV E1E2擴增終產物電泳圖

2.2HCV E1E2序列比對將E1E2測序序列上傳Gene Bank網站，與對應的基因亞型序列進行BLAST比對。可見1b亞型的核苷酸和氨基酸序列的同源性最差。見表2。同時分析HCV E2的高變區(HVR)1和2的序列變異。可見同種基因亞型在HVR 1的變異性最大，而HVR 2的序列變異性不顯著。不同基因亞型的毒株在HVR 1和HVR 2的變異性極大。1b亞型在HVR 1和HVR 2的變異性比1a和2a型突出。見圖2。

2.3HCV E1E2的種系進化樹可見WXR、LSG、ZKX分別為1a、1b和2a亞型毒株。1a與1b亞型在種系進化樹中距離較近，與2a亞型距離較遠。見圖3。

表2同種亞型E1E2區核苷酸及氨基酸的同源性比較(%)

E1E2WXR-1aH77 HC-J1LSG-1bHCVJ HC-C2ZKX-2aJFH1 HC-J6核苷酸90.589.365.466.596.287.8氨基酸92.791.687.189.097.288.9

HVR1區HVR2區

圖2HVR序列比對

圖3HCV E1E2種系進化樹3討論

HCV感染可造成急性、慢性肝炎、肝硬化和肝細胞癌等〔4〕。全球HCV的感染率約為3%。我國抗-HCV陽性率約為3.2%，共有近4 000萬人感染HCV〔2〕。龐大的感染人群加上HCV病毒感染的慢性、隱匿、無疫苗可用等特點，給社會發展帶來沉重的疾病和經濟負擔。HCV存在6種基因型和多種亞型，基因組間的變異性較大，以包膜糖蛋白區(E1E2蛋白)的變異度最高〔5〕。對HCV E1E2蛋白的研究是肝病研究的焦點問題，有助于解答HCV與宿主細胞的吸附感染機制以及保護性疫苗的研發等。

本實驗結果發現中國陜西地方毒株HCV 1b亞型E1E2核苷酸序列與HCV-J株、HC-C2株比較，同源性較差，但比對其氨基酸序列，發現同源性較高。說明該1b亞型毒株E1E2區核苷酸突變頻率極高，但多是同義突變。同時，在相同亞型與不同亞型間比較E2蛋白的HVR 1和2序列，發現1b亞型的變異性比1a和2a型突出。這些結果說明HCV 1b亞型病毒的包膜糖蛋白區更易發生突變，造成復雜的準種現象，從而逃避的機體的免疫識別，也影響臨床干擾素(IFN)治療的療效〔6〕。

HCV E2蛋白的高變區存在中和抗原表位，該抗原表位能夠誘導機體免疫反應，產生保護性抗體，從而阻止HCV的感染。但是高變區序列呈現高度變異性，易發生抗原漂移，導致HCV逃避機體免疫系統的識別監控，引起丙型肝炎的慢性化〔2〕。本研究顯示相同亞型病毒的E2蛋白的高變區變異較小，相同亞型的基因低變異率為研發同亞型毒株的疫苗提供了條件，但是機體產生的保護性抗體可能存在株特異性，在其他亞型病毒的免疫保護作用較弱或無保護作用。提示對HVR 1和2的抗原表位綜合比對，研發多價多肽疫苗或復合基因疫苗，可能會對不同亞型毒株的感染起到交叉免疫保護作用。

4參考文獻

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2中華醫學會肝病學分會，中華醫學會傳染病與寄生蟲病學會.丙型肝炎防治指南〔J〕.中華肝臟病雜志，2004；4(12)：194-8.

3閔峰，郝飛.丙型肝炎病毒包膜糖蛋白與保護性免疫〔J〕.世界華人消化雜志，1999；7(12)：1065-7.

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6李雪黎，雷宇，鐘珊，等.基于2a基因型丙型肝炎病毒自身啟動子的單順反子復制子的構建和功能測定〔J〕.中華肝臟病雜志，2012；20(2)：103-7.

〔2013-11-21修回〕

(編輯安冉冉/曹夢園)