天星健骨膠囊對佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠足爪組織 MMP－2及 MMP－9表達(dá)的影響

天星健骨膠囊對佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠足爪組織MMP-2及MMP-9表達(dá)的影響

楊曉軍苗文麗裴林于素靜1鄭惠軍2

(河北省中醫(yī)藥研究院，河北石家莊050031)

摘要〔〕目的觀察天星健骨膠囊對佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠足爪組織MMP-2、MMP-9表達(dá)的影響。方法采用注射弗氏完全佐劑制作大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎模型，將造模成功的50只SD大鼠隨機(jī)分為模型組、天星健骨膠囊低、中、高劑量組 (0.4、0.6、0.8 g/kg)、地塞米松組 (2 mg/kg)各10只，另設(shè)正常組(10只)。觀察各組大鼠足爪腫脹度；至28 d采用免疫組化法檢測大鼠足爪組織中 MMP-2 和MMP-9蛋白的表達(dá)。結(jié)果模型組和正常組，腫脹度差異顯著(P<0.01)，各治療組腫脹度與模型組比較均有下降(P<0.05或P<0.01)，中藥中、高劑量組MMP-2、MMP-9陽性密度明顯降低(P<0.05或P<0.01)。結(jié)論天星健骨膠囊可明顯改善佐劑性關(guān)節(jié)炎模型大鼠的癥狀，其機(jī)制可能與其下調(diào)MMP-2、MMP-9表達(dá)有關(guān)。

關(guān)鍵詞〔〕天星健骨膠囊；佐劑性關(guān)節(jié)炎；基質(zhì)金屬蛋白酶-2；基質(zhì)金屬蛋白酶-9

中圖分類號〔〕R285.5〔

基金項(xiàng)目：河北省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(No.11276103D-69)

通訊作者：裴林(1961-)，男，教授，碩士生導(dǎo)師，主任醫(yī)師，博士，主要從事濁毒基礎(chǔ)與臨床研究。

1唐山市第四醫(yī)院2唐山市衛(wèi)生監(jiān)督所

第一作者：楊曉軍(1971-)，男，主治醫(yī)師，主要從事骨病臨床研究。

基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)關(guān)節(jié)骨及軟骨的破壞中發(fā)揮重要作用〔1〕。MMP-2、MMP-9 是明膠酶，其作用的底物是關(guān)節(jié)軟骨的重要組成成分。實(shí)驗(yàn)表明MMP-2、MMP-9 與 RA 的病情嚴(yán)重程度及關(guān)節(jié)破壞相關(guān)〔2，3〕。 本文通過觀察天星健骨膠囊對佐劑性關(guān)節(jié)炎模型(AA)大鼠組織中 MMP-2 及 MMP-9 表達(dá)的影響，探討天星健骨膠囊治療RA的作用機(jī)制。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物60只健康雌性SD大鼠，清潔級，起始體重為(200±20)g，由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供(合格證編號：810024)。適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w，自由飲食，12 h光亮/黑暗條件、23～26℃環(huán)境溫度，單籠喂養(yǎng)。

1.2藥物天星健骨膠囊由雷公藤、制南星、土茯苓、青風(fēng)藤、薏苡仁、骨碎補(bǔ)等組成，中藥飲片由河北省中醫(yī)藥研究院飲片廠提供，由河北省中醫(yī)藥研究院制劑室制成濃縮膠囊。地塞米松片為廣東三才醫(yī)藥集團(tuán)有限公司產(chǎn)品，批號：H44024276，規(guī)格：0.75 mg/片。

1.3試劑與儀器弗氏完全佐劑(FCA)由Sigma公司提供；MMP-2、MMP-9免疫組織化學(xué)成套試劑盒均購自北京中山公司；電腦快速冷凍石蠟切片機(jī)(KD-IIIC，中國)；生物顯微鏡(E-600，日本)；圖像分析儀采用德國 Leica 公司生產(chǎn)的 DMIRB E 顯微平臺；MetaMorph 圖像分析系統(tǒng)以及 Olympus 顯微照相系統(tǒng) (PM-10A，日本 OlympusChc 公司)等。

1.4方法

1.4.1造模建立與分組60只大鼠依據(jù)隨機(jī)數(shù)字表分成正常組10只、免疫造模組50只。對每只動物進(jìn)行標(biāo)記。造模方法〔4〕為將大鼠固定，在每只大鼠左足墊皮下注射FCA 0.1 ml，正常組以同樣方法同時(shí)注射等量生理鹽水，然后每天觀察藥物反應(yīng)。至造模第14天，將AA大鼠隨機(jī)分為模型組、地塞米松組、天星健骨膠囊低、中、高劑量組，每組10只。

1.4.2給藥方法于造模第14天開始，正常組、模型組灌服生理鹽水(10 ml/kg)；天星健骨膠囊低、中、高劑量組分別以混懸液(生藥含量0.4、0.6、0.8 g/kg)灌胃；地塞米松組混懸液(2 mg/kg)灌服。1次/d，持續(xù)至28 d。常規(guī)喂養(yǎng)，自由進(jìn)食飲水。

1.4.3足腫脹度測量于造模后第14、21、28天，用足容積測量儀準(zhǔn)確測量，并記錄大鼠左側(cè)足爪容積(以下排水毫升數(shù)計(jì))，求出腫脹度(致炎后足爪容積一致炎前足爪容積)。

1.4.4免疫組化法檢測大鼠足爪組織中 MMP-2和MMP-9蛋白的表達(dá)取大鼠左足跖部位的組織，用中性甲醛溶液固定，石蠟包埋,石蠟切片后常規(guī)脫蠟至水。在此步用體積分?jǐn)?shù)為0.03的H2O2去離子水孵育10 min,進(jìn)行抗原修復(fù)。以0.1 mol/L PBS洗滌5 min 3次。正常山羊血清工作液封閉,室溫孵育10 min。傾去血清，滴加1∶100 稀釋的一抗，對照組用磷酸鹽緩沖液代替一抗作陰性對照。37 ℃孵育 2 h。以0.1 mol/L PBS 洗滌 5 min 3次。滴加生物素化二抗工作液,37℃孵育15 min。以 0.1 mol/L PBS 洗滌 5 min 3 次。滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，37 ℃孵育15 min。以 0.1 mol/L PBS洗滌 5 min 3次。DAB 顯色。蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，封固。MetaMorph圖像分析系統(tǒng)檢測：隨機(jī)檢測5 個(gè)高倍視野(×200)，計(jì)算每個(gè)視野MMP-2和MMP-9的陽性面積比，取其平均值。陽性面積比為每個(gè)視野陽性占整個(gè)視野面積的百分比，以其作為陽性反應(yīng)細(xì)胞密度(簡稱陽性密度)。

2結(jié)果

2.1天星健骨膠囊對AA大鼠足爪腫脹的影響模型組較正常組足爪腫脹度明顯增加(P<0.01)；各藥物治療組均可明顯抑制大鼠足爪腫脹,與模型組比較(P<0.05或P<0.01)。見表1。

2.2天星健骨膠囊對AA大鼠足爪組織中MMP-2、MMP-9 蛋白的影響模型組大鼠組織中MMP-2、MMP-9陽性密度高于正常組(P<0.01);與模型組相比，地塞米松組、天星健骨中、高劑量組陽性密度降低(P<0.01);天星健骨低劑量組與模型組相比有所改善，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

組別14d21d28d正常組0.293±0.0422)0.327±0.0152)0.335±0.0182)模型組0.485±0.0320.815±0.0280.971±0.022地塞米松組0.473±0.0670.614±0.0632)0.552±0.0392)天星健骨膠囊低劑量組0.478±0.0480.774±0.0421)0.832±0.0182)天星健骨膠囊中劑量組0.466±0.0620.663±0.0172)0.516±0.0522)天星健骨膠囊高劑量組0.463±0.0240.559±0.0382)0.411±0.0922)

與模型組比較：1)P<0.05，2)P<0.01

組別MMP-2MMP-9正常組0.10±0.141)0.05±0.231)模型組0.87±0.120.92±0.15地塞米松組0.25±0.211)0.12±0.191)天星健骨膠囊低劑量組0.75±0.190.83±0.12天星健骨膠囊中劑量組0.51±0.111)0.43±0.201)天星健骨膠囊高劑量組0.32±0.151)0.39±0.171)

與模型組比較：1)P<0.01

3討論

MMPs 在 RA 關(guān)節(jié)骨及軟骨的破壞中發(fā)揮重要作用〔1〕。MMP-2 和MMP-9 是其中一大類，又名明膠酶，相對分子質(zhì)量分別為 72 000、95 000。由于其是構(gòu)成細(xì)胞外基質(zhì)(ECM) 降解最重要的酶系統(tǒng)，參與 EMC 的重塑、炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答等〔5〕，MMP-2和MMP-9對 RA的關(guān)節(jié)破壞作用包括：①直接降解軟骨和骨質(zhì);破骨細(xì)胞表達(dá)的 MMP-9 已被證實(shí)對構(gòu)成成熟骨的 ECM 的主要成分-不可溶性Ⅰ型膠原具有末端肽酶活性〔6〕，參與了RA的骨質(zhì)吸收。②在血管生成有重要作用，可以輸送炎癥細(xì)胞到滑膜并為血管翳提供營養(yǎng)，微血管基底膜和間質(zhì)成分被降解，為血管翳的進(jìn)展創(chuàng)造空間。研究發(fā)現(xiàn)在 MMP-2、MMP-9 的作用下可導(dǎo)致慢性滑膜組織增生，表現(xiàn)為滑膜襯里層細(xì)胞增生，炎性細(xì)胞浸潤，滑膜下細(xì)胞增生和炎性細(xì)胞浸潤及滑膜下層血管生成，增生的滑膜組織向關(guān)節(jié)軟骨面生長，形成血管翳〔7〕。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示天星健骨膠囊對AA大鼠的炎癥有治療作用,可能是與其下調(diào)組織中MMP-2、MMP-9的表達(dá)、抑制滑膜組織增生、抑制關(guān)節(jié)軟骨侵蝕、控制血管翳生成有關(guān)。

4參考文獻(xiàn)

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〔2013-01-07修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢園)

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