生姜提取物對阿爾茨海默病大鼠行為學功能的影響

生姜提取物對阿爾茨海默病大鼠行為學功能的影響

曾高峰張志勇魯力肖德強宗少暉1何建明

(廣西醫科大學公共衛生學院，廣西南寧530021)

摘要〔〕目的研究生姜提取物對β淀粉樣蛋白(Aβ)所致阿爾茨海默病(AD)大鼠行為學及大腦神經細胞形態學的影響。方法SD健康大鼠60只，雌雄各半，隨機分成生假手術組和手術組，分別為10只和50只，假手術組側腦室注射生理鹽水，手術組側腦室注射Aβ25～35。造模成功后，建立假手術組(SOP)8只，再將手術組47只隨機分成生姜提取物低、中、高劑量組、石杉堿甲組及空白對照組。各組大鼠予灌胃相應藥物(空白對照組予等量生理鹽水)4 w后，通過Morris水迷宮法評價大鼠學習記憶能力，并以病理組織切片評價大腦病理形態學改變。結果生姜提取物高劑量組、石杉堿甲組潛伏期明顯縮短，神經元細胞數量、層數及胞內尼氏小體增多，在低、中劑量組干預效果不顯著。結論高劑量生姜提取物對AD大鼠具有提高學習記憶能力的作用。

關鍵詞〔〕阿爾茨海默病；β-淀粉樣蛋白(Aβ)；行為學；形態學

中圖分類號〔〕R742〔

基金項目：廣西衛生廳中醫藥管理局課題資助(NO.03301211027)

1廣西醫科大學第一附屬醫院脊柱骨病外科

第一作者：曾高峰(1975-)，女，教授，博士，碩士生導師，主要從事人類營養學研究。

阿爾茨海默病(AD)無比較有效的治療手段，最主要是由于AD不清晰的病因及復雜的發病機制〔1～5〕，AD確切的病理損傷機制仍然是現階段醫學界爭論的難點〔6〕。生姜塊莖中含有多種成分，其中有姜辣素、姜精油、姜酚及黃酮等，還含有多種微量元素〔7〕。本研究通過立體定位儀予側腦室注射β-淀粉樣蛋白(Aβ)25～35及氯化鋁溶液灌胃建立AD大鼠動物模型，觀察在體條件下生姜提取物對Aβ25～35致AD大鼠學習記憶能力方面的形態學及神經細胞病理形態學的影響，并進一步探討生姜提取物對AD的療效及其可能的作用機制。

1材料與方法

1.1實驗動物清潔級健康SD大鼠(雌雄各半)60只，體重210～280 g。購于廣西醫科大學動物實驗中心，本實驗研究符合廣西醫科大學動物保護委員會標準要求，實驗中盡可能減少動物使用數量和減輕動物痛苦。動物予適應性喂養1 w。

1.2試劑生姜提取物：含量為5%姜辣素6-姜辣醇、6-生姜酚、8-姜辣醇、10-姜辣醇，其中6-姜辣醇為主要成分。由上海靈菱食用菌科技有限公司提供。Aβ25～35250 μg(美國Sigma公司)加入無菌生理鹽水，制成1 g/L的溶液，保持在37℃恒溫箱孵育3～7 d，使其老化并成為聚集態的Aβ25～35。

1.3主要儀器SR-5R型腦立體定位儀 (日本成茂公司)；微量注射器 (上海醫用激光儀器廠)；光學顯微鏡(XSP-12C)(上海永亨光學制造有限公司)；病理圖像分析儀(DMR+Q550)(德國LEICA公司)；MT-200 Morris水迷宮視頻跟蹤分析系統。

1.4AD造模方案將大鼠用10%水合氯醛(0.5 μl/g)麻醉，固定于腦立體定位儀上，對耳線跟上頜骨三角固定，保持頭蓋骨水平。剪去頭頂部毛發，碘酊消毒并75%酒精脫碘后切開皮膚，參考Paxinos&Watson的方法選取大鼠側腦室〔8〕，于前囟向后0.8 mm，中線旁開1.4 mm處，三棱針鉆開顱骨，暴露硬腦膜，再用微量注射器緩慢自腦表面垂直進針3.6 mm，將Aβ25～35緩慢注入5 μl(約10 min)，假手術組側腦室注射等量無菌生理鹽水，留針10 min后緩慢撤針，撒些許青霉素粉后，縫合切口，并用碘伏消毒切口。單籠單只飼養待全部大鼠完全清醒并恢復活動。術后應用抗生素，連續3 d肌注青霉素(廣西醫科大學第一附屬醫院藥劑科提供)10萬U/次，2次/d和慶大霉素(廣西醫科大學第一附屬醫院藥劑科提供)1 000 U/次，2次/d。

1.5氯化鋁灌胃待全部大鼠完全清醒并恢復活動并術后愈合后，每日予3%氯化鋁100 mg/kg灌胃。持續30 d。

1.6用藥生姜低、中、高劑量組分別予劑量為10、20、40 g/kg生姜水，每只大鼠每日劑量以生理鹽水兌至5 ml，分2次灌胃；石杉堿甲組予石杉堿甲片100 mg/kg，磨碎后兌生理鹽水至每只大鼠5 ml，分兩次灌胃；空白對照組每只大鼠予生理鹽水5 ml，分2次灌胃；假手術組不予處理。灌胃用藥持續20 d。

1.7Morris水迷宮評價行為學用藥結束后進行Morris水迷宮評價大鼠學習記憶能力。水池溫度保持在(25±3)℃。將大鼠分別從水池四個象限面向池壁隨機放入水池中，觀察大鼠在四個象限找到平臺的時間(潛伏期)，超過120 s后統一記錄成績為120 s。120 s后大鼠還找不到平臺的，引導其到平臺上休息60 s。取四個象限平均值為該次實驗的成績。實驗每天進行1次，持續5 d。

1.8組織取材及常規HE及尼氏染色將大鼠用10%水合氯醛(3 ml/kg)麻醉，取血后快速開胸，將針尖磨平的20 ml注射器針經左心室心尖穿刺達到主動脈插管，并血管鉗夾固定針，以500 ml冷生理鹽水快速沖洗直至流出澄清液，以4%多聚甲醛400 ml灌注固定，維持約60 min。待雙上肢硬化后除去顱蓋骨，取出完整的大腦組織，用上述固定液固定24 h后，取大腦后1/3海馬區豐富為標本，常規脫水，石蠟包埋，作連續冠狀切片，片厚4～5 μm。常規脫蠟。制得切片后常規HE染色及尼氏染色。每張切片于400倍鏡下取10個不同視野，采用病理圖像分析儀及Leica QWIN圖像分析軟件相結合分析同期制作的常規HE及尼氏染色切片。

1.9統計學方法采用SPSS17.0軟件進行單因素方差分析和多重比較(LSD)。

2結果

2.1常規HE及尼氏染色各組在細胞數量、細胞形態和組織結構發生比較明顯的變化(P<0.05)。神經元細胞數量及胞內尼氏小體明顯增加(見表1)；神經元細胞較大，細胞質增多，細胞核固縮程度減輕；神經元排列較整齊，神經元纖維纏結少，細胞層數增多，膠質細胞減少，色深染減輕。

2.2Morris水迷宮空間探索第1天假手術組較生姜提取物組及空白對照組潛伏期明顯縮短(P<0.05)；第2天生姜提取物高劑量組、石杉堿甲組及假手術組較空白對照組潛伏期明顯縮短(P<0.05)，生姜提取物低劑量組較假手術組明顯延長(P<0.05)；第3、4、5天生姜提取物高劑量組、石杉堿甲組及假手術組較生姜提取物低劑量組、中劑量組及空白對照組潛伏期明顯縮短(P<0.05)。見表2。

組別n神經元細胞尼氏小體生姜提取物低劑量組1034.17±7.053)4)5)9.27±3.123)4)5)生姜提取物中劑量組1039.58±7.453)4)5)12.51±4.693)4)5)生姜提取物高劑量組1069.32±10.411)2)6)22.54±5.361)2)6)假手術組876.18±9.511)2)6)27±8.091)2)6)石杉堿甲組1071.23±11.111)2)6)24.37±8.231)2)6)空白對照組733.25±6.133)4)5)9.74±4.433)4)5)

與生姜提取物低劑量組比較：1)P<0.05；與生姜提取物中劑量組比較：2)P<0.05；與生姜提取物高劑量組比較：3)P<0.05;與假手術組比較：4)P<0.05;與石杉堿甲組比較：5)P<0.05;與空白對照組比較：6)P<0.05，下表同

組別n1d2d3d4d5d生姜提取物低劑量組10100.38±33.344)92.31±29.544)87.10±22.173)4)5)82.13±16.343)4)5)60.81±15.953)4)5)生姜提取物中劑量組1096.06±23.5690.19±19.3083.06±19.413)4)5)84.88±20.083)4)5)53.63±14.073)4)5)生姜提取物高劑量組1097.63±22.4183.26±17.76f54.19±17.261)2)6)44.63±18.931)2)6)38.31±15.271)2)6)假手術組884.17±17.251)6)78.09±18.711)6)49.42±16.541)2)6)39.92±13.021)2)6)28.67±12.791)2)6)石杉堿甲組1094.19±25.5678.88±19.31f44.13±17.121)2)6)38.13±15.101)2)6)32.69±14.891)2)6)空白對照組7103.42±27.834)98.5±21.273)4)5)95.25±20.873)4)5)85.17±18.033)4)5)70.08±21.053)4)5)

3討論

Aβ具有神經毒性作用，能直接引起神經元的死亡和誘導的神經細胞凋亡都已被證實〔9〕， Aβ是AD形成并發展的主要因素。因此本研究以Aβ和氯化鋁雙干預建立AD大鼠模型〔10〕。關于AD的發病機制，目前比較認可的假說為氧化應激假說、能量代謝假說、淀粉樣蛋白級聯反應假說以及膽堿能假說等〔11〕，除此之外，還有Aβ神經毒性假說、自由基損傷假說及大腦局部炎癥假說。記憶障礙及學習能力的缺失是AD早期的突出臨床表現，其程度與丟失的及喪失功能的突觸數目相關甚密〔12〕。這在一定程度上說明神經元細胞數目多寡與記憶學習能力強弱等方面密切相關。尼氏小體的本質是糙面內質網的核糖體，與神經遞質的分泌相關，可作為檢測神經元細胞活性的形態學標準，乙酰膽堿是大腦海馬區最主要的神經遞質，大腦內海馬區主要與學習記憶相關，尤其在空間記憶學習的獲得、儲存和提取等一系列過程中發揮重要作用〔13，14〕。本研究提示生姜提取物在高劑量時能提高AD大鼠學習記憶能力。

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〔2013-03-13修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢園)