大鼠呼吸機相關肺損傷自噬相關蛋白的表達及意義

大鼠呼吸機相關肺損傷自噬相關蛋白的表達及意義

劉東雷楊洋吳愷齊宇趙松

(鄭州大學第一附屬醫院胸外科， 河南鄭州450052)

摘要〔〕目的探討大鼠呼吸機所致肺損傷(VILI)過程中自噬相關蛋白的表達及意義。方法健康雄性SPF級SD大鼠 30只，7周齡，體重(220±20)g，實施麻醉和氣管切開術后分別接受不同潮氣量(VT)的通氣(通氣時間均為4 h)。隨機分為三組：對照組(A組，僅切開氣管保留自主呼吸)；常規通氣組(B組，VT=10 ml/kg)；損傷通氣組(C組，VT=40 ml/kg)。A組在氣管切開即刻，其他組在機械通氣結束后放血處死動物，Western印跡檢測肺組織Beclin1和 LC3的表達，計算肺濕/干比重(W/D比值)、MPO活性及肺泡灌洗液中總蛋白含量，光鏡下行白細胞計數。結果在大潮氣量機械通氣4 h后，肺組織中總蛋白、W/D、白細胞計數和MPO等指標均顯著增加(P<0.05)；肺組織中Beclin1、LC3表達水平(1.21±0.11、0.91±0.11)均顯著增加。結論自噬表達的增加參與了大鼠VILI的發生。

關鍵詞〔〕呼吸機相關肺損傷；自噬；肺

中圖分類號〔〕R563〔

基金項目：河南省教育廳科學技術重點研究項目(No.14A320076)；鄭州大學第一附屬醫院青年創新基金

通訊作者：趙松(1963-)，男，教授，主任醫師，博士生導師，主要從事胸部腫瘤基礎與臨床研究。

第一作者：劉東雷(1982-)，男，主治醫師，主要從事自噬與胸外科疾病的相關研究。

機械通氣已經成為搶救急危重癥病人治療的重要措施之一，但由于呼吸機使用不當或使用時間過長引起的肺損傷，即呼吸機所致肺損傷(VILI)已成為機械通氣最嚴重的并發癥之一，若不及時處理可導致患者死亡〔1〕。本研究應用大潮氣量(VT)機械通氣建立大鼠VILI模型，觀察VILI時自噬相關蛋白Beclin1和LC3的表達，探討其在VILI中過程中的意義。

1材料與方法

1.1實驗動物與試劑健康雄性SPF級SD大鼠30只，7周齡，體重(220±20)g(河南省實驗動物中心提供)。Bcelin1和LC3抗體購自Santa Cruz公司，β-actin抗體購自Sigma公司。總蛋白和髓過氧化物酶(MPO)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所。其他試劑均購自Sigma公司。

1.2模型復制與分組30只大鼠隨機分為三組，每組10只。A組為對照組，僅行氣管切開保留自主呼吸；B組為常規通氣組，機械通氣條件為VT 10 ml/kg，呼吸頻率(RR)40次/min，氧體積分數(FiO2)40%；C組為損傷通氣組，機械通氣條件為VT 40 ml/kg，RR 40次/min，FiO240%。B組和C組的通氣時間均為4 h。實驗前12 h禁食，自由飲水。10%水合氯醛3.5 ml/kg腹腔注射麻醉大鼠，氣管切開后插入器官導管行機械通氣，參數設置I∶E為1∶3，呼氣末正壓(PEEP)為零。實驗過程中靜脈給予阿曲庫銨維持肌松，并行皮下切開股靜脈穿刺置管。A組在氣管切開即刻，其余各組在機械通氣結束時立即頸動脈放血處死動物。

1.3標本采集及檢測大鼠處死后立即開胸小心分離兩側肺組織，取右下肺同一部位(約200 mg)立即投入液氮中保存，其余部位的肺組織稱肺濕重，然后置于37℃干燥箱中烤至恒重后稱干重，計算肺濕/干比重(W/D)。左肺用生理鹽水行肺灌洗，回收后1 500 r/min離心10 min，沉淀物用磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋后行瑞氏染色，光鏡下行白細胞(WBC)計數。支氣管肺泡灌洗液(BALF)中總蛋白的測定采用考馬斯亮藍染色，肺組織MPO活性測定采用MPO試劑盒。肺組織中Beclin1和LC3蛋白的表達采用Western印跡法，以β-actin作為標準內對照，圖像應用TotalLab2.0軟件進行灰度分析。

2結果

2.1肺W/D比值、BALF中總蛋白和白細胞計數及MPO含量的比較與A組相比，B組肺組織總蛋白、W/D、WBC和MPO等各項指標的變化均無統計學意義(P>0.05)；與B組相比，C組肺組織總蛋白、W/D、WBC和MPO等各項指標均顯著增加(P<0.05)。見表1。

2.2肺組織Beclin1和LC3的蛋白表達變化A、B、C三組肺組織中Beclin1蛋白表達的相對灰度值分別為0.67±0.05、0.72±0.06、1.12±0.14，LC3為0.52±0.07、0.58±0.08、0.91±0.11。Beclin1和LC3表達C組均顯著高于A、B組(P<0.05)。

檢測指標A組B組C組W/D3.14±0.233.27±0.286.13±0.371)總蛋白(g/ml)0.42±0.060.37±0.074.12±0.291)WBC(×106/L)2.45±0.272.37±0.395.89±0.751)MPO(U/g)2.98±0.783.05±0.986.75±1.181)

與A、B組相比：1)P<0.05

3討論

機械通氣是臨床上常用的治療急性肺損傷的方法，但若使用不當也可導致肺損傷加重。VILI病理學特征主要是肺泡毛細血管通透性增加進而導致肺間質水腫及炎性細胞滲出〔2〕。肺組織W/D的變化可反映肺間質水腫改變的程度。MPO是中性粒細胞釋放的一種過氧化物酶類，可反映肺組織中性粒細胞水平的高低；肺泡灌洗液中WBC計數可反映WBC的浸潤水平。本研究結果顯示，大潮氣量機械通氣誘導的肺組織損傷與肺組織炎性反應有關。

細胞自噬是真核生物中進化保守的對細胞內物質進行周轉的重要過程，能夠通過溶酶體途徑進行降解以實現細胞本身的代謝需要和某些細胞器的更新〔3〕。已有研究表明細胞自噬與炎癥反應之間存在一定程度的關聯〔4〕，在一定條件下自噬能夠減輕細胞炎癥反應。LC3和Beclin1是自噬過程中重要的標志性分子。Beclin1是酵母ATG6的同系物，也是哺乳動物參與自噬的特異性基因，在自噬溶酶體形成的過程中發揮重要作用〔5〕。LC3是哺乳動物細胞中酵母ATG8的同源物，主要定位于前自噬泡和自噬泡膜的表面，其含量的多少與自噬泡數量多少呈正比，因此LC3蛋白的多少是自噬檢測的重要指標之一〔6〕。本結果提示，在大鼠VILI的過程中，自噬相關蛋白參與了大鼠呼吸機相關性肺損傷的發生，與Hussain等〔7〕結果一致。

4參考文獻

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2Carney D,DiRocco J,Nieman G. Dynamic alveolar mechanics and ventilator-induced lung injury〔J〕. Crit Care Med,2005;33(3-1):122-8.

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6Klionsky DJ,Abdalla FC,Abeliovich H,etal.Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy〔J〕. Autophagy,2012;8(4):445-54.

7Hussain SN,Mofarrahi M,Sigala I,etal. Mechanical ventilation- induced diaphragm disuse in humans triggers autophagy〔J〕. Am J Respir Crit Care Med,2010;182(11):1377-86.

〔2013-03-18修回〕

(編輯袁左鳴)