肥胖大鼠尿液 Podocin 檢測及意義

肥胖大鼠尿液Podocin檢測及意義

劉洋胡曼麗劉賢英1

(長春醫(yī)學高等專科學校，吉林長春130061)

摘要〔〕目的探討檢測高脂飲食誘導的肥胖大鼠尿液Podocin的變化。方法實驗大鼠分為正常對照組(Con組)和肥胖組(Ob組)。在造模14 w時，分別用光學顯微鏡、電子顯微鏡方法觀察腎臟形態(tài)變化，用免疫組織化學方法，檢測肥胖大鼠腎小球足細胞Podocin的表達，用ELISA方法檢測尿Podocin蛋白。結(jié)果(1)0 w時Ob組與Con組比較性別、體重、身長、尾長，Lee指數(shù)等無差異，14 w時Ob組體重、身長，Lee指數(shù)明顯高于Con組(P<0.05)。(2)14 w時Ob組與Con組比較血肌酐(Cre)、血尿素氮(BUN)無差異(P>0.05)。(3)Ob組在14 w時尿Podocin排泄明顯多于Con組。(4)光鏡下Ob組大鼠腎小球變化不明顯。電鏡下Ob組大鼠腎臟腎小球足細胞呈粗大狀，足突輕度微絨毛化。(5)免疫組化染色Ob組大鼠腎小球足細胞Podocin的蛋白表達比Con組減少。結(jié)論肥胖大鼠腎小球足細胞Podocin的蛋白表達減少，但尿液Podocin排泄增多，有望成為肥胖導致腎損害的標志物。

關(guān)鍵詞〔〕肥胖；Podocin

中圖分類號〔〕R446.62〔

通訊作者：劉賢英(1966-)，女，副主任護師，博士，主要從事免疫性胃病研究。

1吉林大學第二醫(yī)院

第一作者：劉洋(1973-)，男，副主任醫(yī)師，副教授，碩士，主要從事腎小干擾疾病及相關(guān)并發(fā)癥防治研究。

Podocin是Stomatin蛋白家族成員，人類Podocin約含有383個氨基酸，分子量為42 kD〔1，2〕，主要在腎小球足細胞上表達，可以隨尿液排出體外。本研究采用高營養(yǎng)飲食誘導大鼠制成肥胖動物模型，檢測腎小球足細胞上及尿液中Podocin的表達，旨在探討檢測尿液Podocin在肥胖導致腎損害中的意義。

1材料與方法

1.1肥胖動物模型的建立選擇體重60～100 g之間的健康Wistar大鼠，雌雄不拘，分籠飼養(yǎng)。適應性飼養(yǎng)3 d。 隨機分為正常對照組(Con組)10只；實驗組(Ob組)12只。造模前稱量體重(g)、身長(cm)、尾長(cm)。Con組給予普通飼料，Ob組給予高營養(yǎng)飲食。Ob組與Con組在同一環(huán)境中飼養(yǎng)，自由飲水。Ob組與Con組比較，性別、體重、身長、尾長、Lee指數(shù)無差異。

1.2留取標本在實驗14 w時，Ob組與Con組大鼠均置于代謝籠中，自由飲水，禁食24 h，收集24 h全部尿液，稱取尿液體積(ml)，備檢測尿Podocin蛋白。Ob組與Con組大鼠均乙醚吸入麻醉后，眶后采血約6 ml，離心后備測血肌酐(Cre)、血尿素氮(BUN)。頸椎離斷處死大鼠后，取大鼠左側(cè)腎臟皮質(zhì)迅速放入2.5%戊二醛中固定，制作電鏡標本。腎臟其余部分放入4%多聚甲醛中固定，制作光鏡標本。

1.3觀察指標的測定計算Lee指數(shù)：體重(g)1/3×103/體長(cm)。血Cre、血BUN由生化自動分析儀測定。尿Podocin用ELISA方法檢測，試劑盒由上海分裝。常規(guī)制作石蠟切片，制備HE染色標本。常規(guī)制備電鏡標本，JEM-1200EX型透射電鏡下觀察。免疫組化染色按常規(guī)步驟，試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司，兔抗大鼠Podocin抗體用磷酸鹽緩沖液(PBS)按1∶50倍稀釋，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色。不加一抗為陰性對照，不加任何處理因素為空白對照，結(jié)果判定：棕黃色小顆粒。

2結(jié)果

2.1身長、體重比較14 w時，Ob組與Con組比較，體重、身長、尾長、Lee指數(shù)差異顯著(P<0.05)。見表1。

組別n體重(g)身長(cm)尾長(cm)Lee指數(shù)Con組10252.45±59.4720.80±1.6119.13±1.33264.00±38.17Ob組12367.92±88.881)23.15±2.181)19.91±1.26328.19±9.821)

與Con組比較：1)P<0.05；下表同

2.2尿液的變化Ob組尿液Podocin排泄明顯多于Con組 (P<0.05)，血生化的改變：14 w時Ob組與Con組比較血Cre、BUN無差異(P>0.05)。見表2。

組別nPodocin(mg/L)BUN(mmol/L)Cre(μmol/L)Con組100.72±0.215.59±1.7363.5±15.88Ob組121.21±0.041)3.73±1.1058.42±8.67

2.3光鏡下腎臟病理觀察結(jié)果Con組大鼠腎臟正常組織結(jié)構(gòu)。Ob組大鼠腎小球結(jié)構(gòu)基本正常，沒有明顯變化。

2.4電鏡下腎臟皮質(zhì)觀察結(jié)果Con組大鼠腎臟腎小球為正常結(jié)構(gòu)。Ob組大鼠腎臟腎小球濾過膜結(jié)構(gòu)完整，內(nèi)皮細胞呈固縮狀細胞核，核內(nèi)染色質(zhì)趨邊凝聚；基底膜輕度增厚，偶見雙軌征；足細胞呈粗大狀，核呈不規(guī)則形，胞質(zhì)內(nèi)線粒體腫脹，可見次級溶酶體，還可見均質(zhì)狀圓形小體，足突輕度微絨毛化；系膜區(qū)基質(zhì)增生，系膜細胞數(shù)量增多，細胞核呈不規(guī)則型，核內(nèi)異染色質(zhì)趨邊凝聚；毛細血管腔內(nèi)可見大量紅細胞。見圖1。

圖1　兩組大鼠腎臟結(jié)構(gòu)電鏡結(jié)果(×7 500)

2.5腎臟皮質(zhì)免疫組化染色結(jié)果Con組大鼠腎臟橫切面上腎小球足細胞被染成濃厚的棕黃色，著色部位以細胞膜和細胞質(zhì)為主。Ob組大鼠腎臟橫切面上腎小球足細胞被染成淺棕黃色，著色部位以細胞膜和細胞質(zhì)為主。見圖2。

圖2　各組大鼠腎臟Podocin免疫組織化學染色 (DAB染色，×400)

3討論

肥胖是遺傳因素和環(huán)境因素共同作用的結(jié)果，鑒于臨床中大多數(shù)肥胖患者是由于高熱量飲食導致。幼年動物對高脂食物更敏感，所以實驗選擇體重60～100 g之間的健康Wistar大鼠。本實驗成功復制了營養(yǎng)性肥胖大鼠模型。

本實驗結(jié)果為肥胖大鼠產(chǎn)生蛋白尿提供有力的形態(tài)學依據(jù)，也正是腎功能早期改變的證據(jù)。而此時反映腎小球濾過功能的其他指標包括BUN、血Cre和血尿酸等尚無明顯改變。綜合分析以上評價肥胖大鼠腎臟機能和形態(tài)的各指標的改變，認為肥胖大鼠在14 w時可以導致腎臟受損，但其腎小球損害程度較輕或尚屬病變的早期階段。

本研究中免疫組化結(jié)果顯示，Ob組大鼠腎臟橫切面上腎小球足細胞被染成淺棕黃色，著色部位以細胞膜和細胞質(zhì)為主，與Con組比較，染色淺且分布不連續(xù)。與有關(guān)報道一致〔3〕。還有研究者進一步采用熒光實時定量PCR 方法在基因水平測定足細胞Podocin的表達，發(fā)現(xiàn)mRNA明顯升高〔4〕。

有關(guān)足細胞損傷在肥胖導致蛋白尿中的作用報道不多，但有動物實驗表明，在大鼠微小病變腎病模型中，Podocin的改變早于足細胞超微結(jié)構(gòu)的改變和蛋白尿的發(fā)生，結(jié)合Spearman相關(guān)分析提示，Podocin蛋白表達水平與蛋白尿的發(fā)生密切相關(guān)〔5〕。有研究認為Podocin蛋白下調(diào)，可能是足突裂孔隔膜和足突細胞骨架受到破壞〔6〕，Podocin從尿中丟失的結(jié)果，進而導致了足突形態(tài)的改變和蛋白尿的發(fā)生。本實驗檢測肥胖的大鼠尿中Podocin蛋白進一步證實以上推測。

綜上所述，目前還沒有肥胖導致腎臟損害的標志物，而本實驗僅是檢測了足細胞標志物Podocin在尿液中的改變，如果將Podocin推向臨床應用，還需要深入研究和廣泛的觀察。

4參考文獻

1Boute N，Gribouval O，Roselli S，etal.NPHS2，encoding the glomerular protein podocin，is mutated in autosomal recessive steroid-resistant nephritic syndrome〔J〕.Nat Genet，2000；24(4)：349-54.

2V?lker LA，Schurek EM，Rinschen MM，etal.Characterization of a short isoform of the kidney protein podocin in human kidney〔J〕.BMC Nephrol，2013；14(10)：102.

3Boini KM，Zhang C，Xia M，etal.Role of sphingolipid mediator ceramide in obesity and renal injury in mice fed a high-fat diet〔J〕.J Pharmacol Exp Ther，2010；334(3)：839-46.

4林帆，羅敏，林苗.肥胖大鼠足細胞Nephrin、Podocin、Podoplanin 的表達〔J〕.福建醫(yī)科大學學報，2009；43(4)：283-7.

5沙玉根，張愛華，陳榮華，等.Podocin在大鼠微小病變模型中的餓表達和分布〔J〕.腎臟病與透析腎移植雜志，2004；13(2)：211-4.

6Lehtonen S，Zhao F，Lehtonen E.CD2-associated protein directly interacts with the actin cytoskeleton〔J〕.Am J Physiol Renal Physiol，2002；283(4)：F734.

〔2013-11-03修回〕

(編輯袁左鳴)