維吾爾族和漢族女性散發性乳腺癌BRCA1及BRCA2基因單核苷酸多態性研究

通信作者：張巍，女，主任醫師，博士生導師，研究方向：腫瘤分子病理學，E-mail:zwyhr100@163.com。

·民族腫瘤學·

維吾爾族和漢族女性散發性乳腺癌BRCA1及BRCA2基因單核苷酸多態性研究

緱文斌， 王智， 苗娜， 張巍

(新疆醫科大學第一附屬醫院病理科， 烏魯木齊830054)

摘要：目的研究新疆漢族及維吾爾族女性散發性乳腺癌患者BRCA1及BRCA2基因單核苷酸多態性(Single Nucleotide Polymorphisms，SNP)的差異。方法收集新疆醫科大學第一附屬醫院手術切除并經病理確診為乳腺癌100例患者的活檢樣本,維吾爾族和漢族患者各50例。BRCA1基因引物設計參考NM_007300.3和NC_000017.11，BRCA2基因引物設計參考NM_000059.3和NC_000013.11,合成引物后對BRCA1及BRCA2基因SNP位點進行測序，采用SPSS17.0統計軟件對數據進行卡方檢驗。結果在BRCA1-Exon10上有2個單核苷酸多態性位點(rs16941及rs16942)。BRCA1-Exon2內含子上有1個突變位點(Introns1-1125)。BRCA2基因未檢測到基因多態性。BRCA1基因，rs16941位點的AA、AG、GG 3個基因型在漢族和維吾爾族患者中的分布頻率差異有統計學意義(P=0.009)。rs16942位點的AA、AG、GG 3個基因型在漢族和維吾爾族患者中的分布頻率差異有統計學意義(P=0.017)。rs16941位點，相對于AA基因型，AG、GG基因型能增加維吾爾族乳腺癌患者的易感性[OR值(95%CI)分別為2.498(1.033～5.994)及6.519(1.606～26.464)]。rs16942位點，相對于AA基因型，AG、GG基因型能增加維吾爾族乳腺癌患者的易感性[OR值(95%CI)分別為2.368(0.995～5.637)及5.741(1.395～23.630)]。結論BRCA1基因，rs16941及rs16942位點的AA、AG、GG 3個基因型的分布頻率在漢族和維吾爾族患者中存在差異。rs16941及rs16942位點，相對于AA基因型，AG、GG基因型能增加維吾爾族乳腺癌患者的易感性。

關鍵詞:乳腺癌; BRCA1及BRCA2基因; 單核苷酸多態性; 種族差異

基金項目：新疆維吾爾自治區科技支疆計劃項目(201291172)

作者簡介：緱文斌(1981-)，男，在讀碩士，主治醫師，研究方向：腫瘤病理學。

中圖分類號：R737.9

doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2015.03.007

[收稿日期：2014-10-20]

Research about single nucleotide polymorphisms of BRCA1 and BRCA2

gene between Han and Uyghur female patients with sporadic breast cancer

GOU Wenbin， WANG Zhi， MIAO Na, ZHANG Wei

(DepartmentofPathology,FirstAffiliatedHospital,XinjiangMedicalUniversity,

Urumqi830054,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate differences in single nucleotide polymorphisms (Single Nucleotide Polymorphisms, SNP) of BRCA1 and BRCA2 genes between Han and Uygur female patients with sporadic breast cancer in Xinjiang. MethodsWe collected biopsy samples of 100 patients who had undergone surgical removal and had been pathologically diagnosed as breast cancer sufferers, including 50 Uyghur and 50 Han in The First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University. BRCA1 gene primer was designed according to NM_007300. 3 and NC_000017. 11. BRCA2 gene primer was designed according to NM_000059. 3 and NC_000013. 11. The gene sequencing of BRCA1 and BRCA2 was decided after synthetic primer. The data were analyzed by SPSS17.0 statistics software. ResultsThere were two locus(rs16941 and rs16942) of single nucleotide polymorphisms on the BRCA1-Exon10. Another a mutation locus (Introns1-1125) was found on BRCA1-Exon2 introns. BRCA2 gene polymorphism was not detected. Statistically significant differences were found in the frequency distribution of genotype AA, AG and GG on rs16941 (P=0.009) and rs16942 (P=0.017)of BRCA1 between Han and Uygur patients. Compared with the AA genotype, the susceptibility of Uyghur patients with breast cancer was increased in AG and GG genotypes (odd ratio (95% CI): 2.498 [(1.033-5.994) and 6.519 (1.606-26.464)]as well as in rs16942 locus (odd ratio (95% CI): 2.368 [(0.995-5.637) and 5.741 (1.395-23.630)]. The relationship between BRCA1 gene rs16941 and rs16942 locus and the clinical pathological characteristics were analyzed, whereas there were no statistical differences. ConclusionSignificant differences were found in the genotype AA, AG and GG on rs16941 and rs16942 of BRCA1 between Han and Uygur patients. In rs16941 and rs16942 locus, AG and GG genotypes might increase the susceptibility of Uyghur patients with breast cancer.

Key words： breast cancer; BRCA1 and BRCA2 gene; Single Nucleotide Polymorphisms; ethnic difference

新疆是我國維吾爾族最主要聚居區，維吾爾族乳腺癌患者在日常臨床工作中所占比重較大。近年來，維吾爾族婦女乳腺癌發病率逐年增高，且大多數發現較晚，以Ⅱ、Ⅲ期居多，嚴重地危害著婦女的身心健康。目前國內外的研究發現乳腺癌的易感基因主要有BRCAl/2、C-MYC、ORAI1、Rad-3相關蛋白(ATR)、細胞周期檢查點激酶1(CHEK1)、切除修復交叉互補基因1(ERCC1)、DNA修復基因XPF、人類表皮生長因子受體2(HER-2)、細胞周期素1(cyclinD1)、成纖維細胞生長因子受體2(FGFR-2)及其受體基因等[1-5]，其中BRCAl及BRCA2基因與乳腺癌發病風險高度相關，是乳腺癌最主要的易感基因。乳腺癌BRCA1及BRCA2基因作為腫瘤抑制基因，其結構與功能的異常與乳腺癌的發生、發展及預后密切相關。而SNP與突變是基因結構與功能改變的主要原因。乳腺癌BRCA1及BRCA2基因突變位點眾多，且不同種族的高發突變位點存在差異[6-8]，其中BRCA1基因以外顯子(exon)2、10、20的突變多見，BRCA2基因以外顯子(exon)11的突變多見[8]。本研究選擇100例散發性乳腺癌(50例漢族和50例維吾爾族)，對BRCA1的外顯子2、10、20及BRCA2的11號外顯子進行SNP位點的檢測，旨在比較新疆漢族和維吾爾族乳腺癌患者BRCA1和BRCA2基因多核苷酸多態性是否存在差異,現報道如下。

1材料與方法

1.1標本來源收集2004年12月-2014年3月由新疆醫科大學第一附屬醫院手術切除并經病理醫師確診為乳腺癌的100例活檢樣本。維吾爾族和漢族乳腺癌患者各50例，年齡為27～76歲，平均年齡48歲。所有患者均為散發性乳腺癌患者，無明確腫瘤家族史。

1.2基因組DNA的提取方法將腫瘤組織蠟塊按5 μm厚度切片3～5張，收集于EP管中，按照基因組DNA提取試劑盒QIAamp DNA FFPE Tissue Kit(Qiagen，Cat#56404)說明書進行DNA提取。提取產物經核酸蛋白定量儀NanaDrop 2000檢測DNA濃度，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的完整程度。合格標準OD260/OD280>1.6,濃度>30 ng/μL,瓊脂糖凝膠電泳有主帶。

1.3PCR擴增及基因型分析所有核酸序列位置編碼參考NCBI GenBank 中野生型 cDNA 序列 BRCA1(U14680.1)和 BRCA2(U43746.1)。BRCA1基因引物設計參考NM_007300.3和NC_000017.11，BRCA2基因引物設計參考NM_000059.3和NC_000013.11，序列詳見表1。合成引物后，收集質檢合格的100例DNA樣本，在預先配置好的PCR反應體系中進行擴增。反應體系為30 μL，包括模板DNA模板0.6 μL，10×PCR緩沖液(含Mg2+)5 μL，10 mmol/L dNTP 混合物 0.6 μL，Pfu DNA聚合酶(Tiangen,EP101)0.3 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各 0.6 μL。反應條件: 95℃ 5 min; 95℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 60 s，共40個循環。取PCR 產物 5 μL 經 1.5% 瓊脂糖凝膠電泳鑒定，PCR產物利用Applied Biosystems 3730XL DNA Analyser測序。測序圖形用Chromas Pro 1.33軟件分析。

1.4數據分析所有核酸序列位置編碼參考美國NCBI GenBank 中野生型 cDNA 序列 BRCA1(U14680.1)和 BRCA2(U43746.1)。所檢測到的突變位點在乳腺癌信息中心網站數據庫(Breast Cancer InformationCore，BIC) 比較，確定是否為新的突變位點。對其中發現的變異位點行Hardy-Weinberg平衡檢驗，確定其是否符合遺傳平衡定律。進一步利用SPSS17.0 統計軟件對變異位點進行卡方檢驗， P<0.05 為差異有統計學意義。

表1　PCR引物序列、反應條件及擴增條件

2結果

2.1BRCA1及BRCA2基因單核苷酸多態性檢測結果在BRCA1-Exon10上有2個突變位點(rs16941及rs16942),均引起錯義突變,導致rs16941位點谷氨酸(Glu)改變為甘氨酸(Gly),rs16942位點的賴氨酸(Lys)改變為精氨酸(Arg)。在BRCA1-Exon2內含子上有1個突變位點(Introns1-1125)。BRCA2基因未檢測到基因單核苷酸多態性位點,見表2。

2.2BRCA1基因rs16941及rs16942位點Hardy-Weinberg平衡檢驗BRCA1基因rs16941及rs16942位點經Hardy-Weinberg平衡檢驗，差異無統計學意義，見表3。

表2　BRCA1Exon10及BRCA1Exon2上SNP檢測突變位點信息

　　注：Glu：谷氨酸; Gly：甘氨酸; Lys：賴氨酸; Arg：精氨酸。

2.3BRCA1基因rs16941及rs16942位點及Introns1-1125內含子分型圖將PCR擴增產物利用Applied Biosystems 3730XL DNA Analyser測序和基因型分析,測序圖形用Chromas Pro 1.33軟件分析,見圖1。

2.4BRCA1基因rs16941及rs16942位點在維吾爾族和漢族患者中的分布rs16941位點在漢族和維吾爾族患者中有AA、AG、GG 3種基因型，漢族3種基因型的頻率分布為64%、30%、6%，維吾爾族3種基因型的頻率分布為36%、42%、22%，3種基因型的頻率分布差異有統計學意義(P=0.009)。相對于AA基因，AG和GG基因型可能增加維吾爾族乳腺癌患者的易感性，OR值(95%CI)分別為2.498(1.033～5.994)及6.519(1.606～26.464)。rs16942位點在漢族和維吾爾族患者中有AA、AG、GG 3種基因型，漢族3種基因型的頻率分布為62%、32%、6%，維吾爾族3種基因型的頻率分布為36%、44%、20%，3種基因型的頻率分布差異有統計學意義(P=0.017)。相對于AA基因型，AG和GG基因型可能增加維吾爾族乳腺癌發病的易感性，OR值(95%CI)分別為2.368(0.995～5.637)及5.741(1.395～23.630)，見表4。BRCA1Exon2 Introns1-1125位點僅漢族中1例病人發生內含子突變，無臨床意義。

A：BRCA1Exon10 rs16941位點AA基因分型圖；B：BRCA1Exon10 rs16941位點AG基因分型圖；C：BRCA1Exon10 rs16941位點GG基因分型圖；D：BRCA1Exon10 rs16942位點AA基因分型圖；E：BRCA1Exon10 rs16942位點AG基因分型圖；F：BRCA1Exon10 rs16942位點GG基因分型圖；G：BRCA1Exon2 內含子Introns1-1125位點TT基因分型圖；H：BRCA1Exon2 內含子Introns1-1125位點GT基因分型圖

圖1　BRCA1基因rs16941及rs16942位點及Introns1-1125內含子分型圖

3討論

BRCA1定位于人類17號染色體q21，以常染色體顯性遺傳方式遺傳，并有很高的外顯率。BRCA1是一種腫瘤抑制基因，在染色體上的跨度大約為100 kb，編碼區為55.5 kb，含高達41.5的Alu重復序列，含24個外顯子。BRCA1作為抑癌基因在基因表達與轉錄調控、基因突變及DNA 損傷和修復等多個方面發揮作用，與乳腺癌的發生、發展及預后密切相關[9]。BRCA2基因定位于13號染色體q12，在染色體上的跨度大約為70 kb，其中編碼區含有10 987 bp，且富含AT(約64%)，其基因序列與BRCA1無明顯關系。BRCA2由27個外顯子組成，BRCA2與雙鏈DNA損傷修復有關，但具體作用模式與機制仍不清楚[9]。 當其發生突變時，發生遺傳性乳腺癌、卵巢癌、胃癌、胰腺癌及前列腺癌的概率也明顯增加[10]。

SNP是繼限制性片段長度多態性、DNA單鏈構象多態性之后出現的第三代遺傳標記。SNP是疾病易感性、藥物敏感性等生物性狀差異的重要遺傳學基礎。因此SNP的相關研究將會為疾病的診斷、預防和治療等個體化醫療發展提供重要數據基礎和理論依據。乳腺癌的發病風險與SNP位點和易感基因的突變個數及其本身的危險性呈高度相關，突變個數越多，突變的SNP位點和易感基因的危險性越高，發生乳腺癌的概率也就越大[7]。

國外研究發現BRCA1基因SNP多態性位點超過120個，其中10個位于BRCA1基因的編碼區[5]。而不同民族、不同地區乳腺癌BRCA1基因SNP位點改變也不盡相同，SNP作為乳腺癌的易感因素對乳腺癌發生、發展的作用也不盡相同。Chen等[11]研究發現rs1271572位點的TT基因型能增加乳腺癌的患病風險且與較差的預后密切有關。Vahtefist等[12]研究顯示，Pro24Ser和ValS07Met等位基因的SNPs能夠降低乳腺癌的患病風險。孫剛等[13]對新疆維吾爾族乳腺癌BARD1基因多態性的研究發現，Pro24Ser(C/T)、Arg378Ser(G/C)及Val507Met(G/A)位點的SNPs改變能夠顯著降低新疆地區維吾爾族早發性乳腺癌的發病風險，并且各位點之間存在顯著的協同作用和交互作用。

本研究選擇50例漢族及50例維吾爾族乳腺癌患者作為研究對象，對其BRCA1及BRCA2基因SNP位點進行測序，比較其在漢族及維吾爾族乳腺癌患者中是否存在差異。結果發現在BRCA1Exon10上有2個突變位點(rs16941及rs16942),均引起錯義突變，導致rs16941位點谷氨酸(Glu)改變為甘氨酸(Gly)，rs16942位點的賴氨酸(Lys)改變為精氨酸(Arg)。1例漢族乳腺癌患者BRCA1-Exon2內含子上有1個突變位點(Introns1-1125)。BRCA2基因未檢測到基因多態性。BRCA1基因，rs16941位點的AA、AG、GG 3個基因型在漢族和維吾爾族患者的頻率分布差異有統計學意義(P=0.009)。rs16942位點的AA、AG、GG 3個基因型在漢族和維吾爾族患者的頻率分布差異有統計學意義(P=0.017)。rs16941位點，相對于AA基因型，AG、GG基因型能增加維吾爾族乳腺癌患者的易感性[OR值(95%CI)分別為2.498(1.033～5.994)及6.519(1.606～26.464)]。rs16942位點，相對于AA基因型，AG、GG基因型能增加維吾爾族乳腺癌患者的易感性[OR值(95%CI)分別為2.368(0.995～5.637)及5.741(1.395～23.630)]。因此，BRCA1基因rs16941及rs16942位點的AA、AG、GG 3個基因型在漢族和維吾爾族患者間存在差異。相對于AA基因型，AG、GG基因型改變可能與維吾爾族乳腺癌發病的易感性增高有關。Cox等[6]研究發現攜帶稀有等位基因C的野生型BRCA1基因的rs16942位點能降低乳腺癌的發病風險(OR值0.86, 95%CI 0.77～0.95)。Luisel等[14]研究發現rs16941位點與乳腺癌易感性之間無明確的關系。上述研究與本研究結果不一致，可能與SNP在不同的民族、地區的分布及研究對象的選取及標本量較小等有關。

綜上所述，本研究對50例漢族及50例維吾爾族乳腺癌BRCA1及BRCA2基因進行SNP位點測序，并對實驗結果進行分析。BRCA1基因rs16941及rs16942位點，相對于AA基因型，AG、GG基因型改變可能與維吾爾族乳腺癌的發病易感性增高有相關性。但是，因為本研究樣本量較小，且選擇研究的對象均為散發性乳腺癌,因此要詳細闡明乳腺癌BRCA1基因與SNP的關系，還需要對不同地區、不同種族進行多位點、大樣本的深入細致的研究。

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(本文編輯楊晨晨)