缺氧時乳腺癌細胞HIF-1α與CXCR4表達及遷移調控的實驗研究

通信作者：郭麗英，女，碩士，主任醫師，博士生導師，研究方向：乳腺外科，E-mail: 2315365607@qq.com。

缺氧時乳腺癌細胞HIF-1α與CXCR4表達及遷移調控的實驗研究

付明剛1， 哈麗旦·肉孜2， 郭麗英1

(1新疆醫科大學第一附屬醫院乳腺外科, 烏魯木齊830054，2烏魯木齊市杭州路衛生服務中心, 烏魯木齊830026)

摘要：目的探討缺氧時乳腺癌細胞缺氧誘導因子HIF-1α(HIF- 1α) 與趨化因子4(CXCR4)的表達及其對乳腺癌細胞遷移調控的影響。方法將MDA-MB-231乳腺癌細胞置入缺氧盒中,建立3%缺氧微環境，設為缺氧24 h組及缺氧48 h組，對照組為正常培養的乳腺癌細胞；采用MTT法測定乳腺癌細胞的增殖能力, RT-PCR法檢測HIF-1α與CXCR4mRNA表達量，同時檢測添加維生素C(VitC)后HIF-1α與CXCR4mRNA的mRNA表達水平：Transwell小室測定各組細胞的遷移能力。結果與對照組比較，缺氧24、48 h組細胞增殖能力明顯增加；缺氧24 h組、缺氧48 h組HIF-1α、CXCR4 mRNA表達和細胞的遷移能力明顯高于對照組(P<0.05) ; 缺氧24 h+VitC組、缺氧48 h+VitC組HIF-1α、CXCR4 mRNA表達和細胞的遷移能力與對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)。結論缺氧能增加細胞的增殖能力，能增加乳腺癌細胞HIF-1α、CXCR4mRNA表達和遷移能力,但能被抗氧化劑VitC有效阻斷，提示HIF- 1α可望成為抑制乳腺癌轉移的治療靶點。

關鍵詞：缺氧; 缺氧誘導因子- 1α; CXCR4; 乳腺癌

基金項目：省部共建國家重點實驗室培育基地—新疆重大疾病醫學重點實驗室專項(SKLI-XJ-MDR-ZX-2014-1)

作者簡介：付明剛 (1978-), 男，在讀博士，主治醫師，研究方向：乳腺外科。

中圖分類號：R34

doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2015.03.010

[收稿日期：2014-09-10]

Experimental research of the expression of HIF-1 alpha and CXCR4 and

regulation of the migration in hypoxic breast cancer cells

FU Minggang1, Halidan Rouzi2, GUO Liying1

(1DepartmentofBreastSurgery,FirstAffiliatedHospital,XinjiangMedicalUniversity,

Urumqi830054,China;2TheHealthCenterofHangZhouRoad,Urumqi830026,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the expressions of hypoxia inducible alph (HIF-1α) and chemokine receptor 4 (CXCR4) and the influence of the regulation of cell migration in hypoxia breast cancer cells. MethodsThe MDA-MB-231 breast cancer cell was put into Hypoxic box Hypoxic box, and then the hypoxic environment was constructed. The cells were divided into control group, hypoxia 24 h group and hypoxia 48 h group. The breast cancer cells in the control group were cultured without any interference. The researchers used MTT to test breast cancer cell proliferation ability and RT-PCR method to detect mRNA expression amount of HIF-1α and CXCR4 and their expression level after adding VitC. The cell migration ability of each team was determined by Transwell methods. ResultsThe proliferation of the cells in hypoxia 24 h group and hypoxia 48h group significantly increased compared to that in the control group. HIF-1α, CXCR4 expression and cell migration in hypoxia 24h group and hypoxia 48h group were significantly higher than that in the control group (P<0.05). The differences in HIF-1α, CXCR4 expression and cell migration between the hypoxia 24 h+VitC group and control group and between hypoxia 48 h+VitC group and control group were not statistically significant (P>0.05). ConclusionHypoxia can increase the proliferative capacity of breast cells and increase HIF-1α, CXCR4 expression and migration of the breast cancer cells, but these processes can be effectively inhibited by the antioxidant VitC. It suggests that HIF-1α is expected to become a new target to inhibit the process of the metastasis in breast cancer.

Key words: hypoxia; HIF-1α; CXCR4; breast cancer

乳腺癌是女性最常見的腫瘤，且乳腺癌的發病率呈增高趨勢[1]。雖然以手術為主的綜合治療可以取得較好的臨床療效,但復發和轉移仍然是影響患者生存率和死亡率的主要因素，尤其轉移是絕大多數患者癌癥晚期的癥狀和致死的主要原因[2]。目前乳腺癌轉移潛在的分子機制目前尚未完全闡明。缺氧誘導因子1α(HIF-1α)作為多種信號途徑的上游調控因子調控細胞凋亡、糖酵解、血管新生等多種腫瘤代謝過程，促進腫瘤生長。近年來，趨化因子受體在乳腺癌發展中的作用得到了廣泛關注，尤其是趨化因子受體(CXCR4)與其配體SDF-1 形成的CXCR4 /SDF-1軸在腫瘤生長、侵襲和轉移中也具有重要作用[3-4]。有研究表明缺氧可能與CXCR4在乳腺癌發生發展過程中誘導因子有協同作用[5]。但是，缺氧對乳腺癌HIF-1α、CXCR4 的表達及維生素C(VitC)相關作用機制及其影響卻鮮有報道。本實驗通過觀察缺氧對乳腺癌細胞HIF-1α、CXCR4 表達及遷移能力的影響以及與VitC相關作用機制，期望為臨床治療乳腺癌提供理論依據。

1材料與方法

1.1試劑與材料高侵襲性人乳腺癌細胞系MDA-MB-231(上海信然生物科技有限公司)，CXCR4 抗體為Abcam 公司產品，維生素C(VitC)，1640 培養液及胎牛血清均為Gibco公司產品，Transwell 小室購自北京樂博生物科技有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1細胞培養MDA-MB-231 乳腺癌細胞用含10% 胎牛血清、100 U/mL 青霉素和100 U/mL卡那霉素的1640 培養液，于37℃、5%CO-2培養箱中培養，常規換液傳代。

1.2.2缺氧培養方案將MDA-MB-231乳腺癌細胞先放入缺氧盒中,使用缺氧混配器(長沙長錦公司)將氣體(3% O-2、5%CO-2及90%N)混合,并將混合后的氣體注入缺氧盒,從而建立缺氧微環境。實驗分為缺氧24 h 組、48 h組和正常對照組(正常培養的乳腺癌細胞)，每組實驗為6次后取均值。

1.2.3MTT法測定乳腺癌細胞的增殖率將缺氧干預后的細胞用0.25%胰蛋白酶液消化，收集細胞，調節細胞濃度為1×10+4/mL，于96孔板每孔加0.2 mL，同時設空白對照組，只加入培養基，37℃分別培養24 h和48 h后，棄去培養液，PBS洗1次，每孔加0.1 mL PBS和10 μL MTT染液，在37℃、5%CO-2培養箱中培養4～6 h。棄去培養液，每孔加DMSO100 μL，震蕩，在酶聯免疫檢測儀上選擇570 nm 波長，測定每孔的光密度值(OD值)。

1.2.4RT-PCR法檢測HIF-1α與CXCR4 mRNA表達水平及添加VitC后HIF-1α與CXCR4mRNA的mRNA表達水平按照以上分組收集處理后的細胞，Trizol法提出總RNA，逆轉錄為cDNA后進行PCR。PCR反應體系為：Mix：10 μL，HIF-1α上游引物:5′-GGAAACTTCTGGATGCTGGTGAT-3′，下游引物:5′-CACTTCATTCTGAGAAAAAAGCTTC-3′，擴增片段 310 bp。CXCR4上游引物5′-AGGTGGTCTATGTTGGCGTCTGGAT-3′,下游為5′-AGGATGGGGATGATTGTGGTCTTGA-3′,SDF-1各1 μL，擴增片段大小291 bp。cDNA:1.5 μL，dd H-2O：6.5 μL，總計20 μL。取PCR產物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳35 min，以β-actin基因作為內參照，采用GDS8000凝膠自動成像儀掃描分析并相對處理。

1.2.5Transwell小室實驗檢測細胞遷移能力細胞按照各組處理后加入上室內，下室內加入含SDF-l(200 nM)的500 μL的培養液，各組細胞在趨化因子誘導下可穿過多孔濾膜，由小室的上室面遷移至小室的下室面，0.1%的結晶紫染色20 min(結晶紫用無水甲醇配成0.5%的母液，用時稀釋成0.1%)，PBS清洗2次，24孔板加入PBS，10%乙酸(100 μL)溶解，將溶解的液體轉入96孔板中用酶標儀讀數(OD=560 nm),結果用倍數比表示各組數據，對照組定為100%，其他各組數據與對照組進行比較得到倍數比,實驗重復3次。

1.3統計學處理使用SPSS13.0統計軟件完成統計學處理，計量資料以均數±標準差(±s)表示，組間差異比較采用單因素方差分析, P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1缺氧對乳腺癌細胞增殖能力的影響與正常對照組比較，在缺氧24 h后，3%缺氧組細胞增殖能力顯著升高(P<0.05)(A 值表示乳腺癌細胞的增殖程度)；而且24 h缺氧組與48 h缺氧組比較細胞增殖能力無明顯變化(P>0.05)，見表1。

表1　3%缺氧對MDA-MB-231 增殖的影響( ±s)

表1　3%缺氧對MDA-MB-231 增殖的影響( ±s)

分組檢測次數A值正常對照組60.12±0.0283%缺氧24h組60.21±0.0213%缺氧48h組60.22±0.047

注：注：與正常對照組比較,*P<0.05。

2.2缺氧對乳腺癌HIF-1α和CXCR4 mRNA的影響與正常對照組比較，3%缺氧24 h、48 h組細胞HIF-1α和CXCR4 mRNA顯著升高(P<0.05)(表2)，但3%缺氧24 h+VitC和3%缺氧48 h+VitC 組細胞與對照組比較無明顯差異(P>0.05),見圖1、2，表2。

圖1　缺氧24 h對乳腺癌HIF-1α和CXCR4 mRNA表達的影響

圖2　缺氧48 h對乳腺癌HIF-1α和CXCR4 mRNA

分組檢測次數R值24h48h正常對照組62.562.863%缺氧組65.656.623%缺氧+VitC組63.013.22

注：注: R值為相對mRNA水平，與正常對照組比較,*P<0.05。

2.3Transwell小室測定各組細胞遷移能力與正常對照組比較，3%缺氧24 h組、48 h組細胞遷移能力明顯升高(P<0.05)，但3%缺氧24 h+VitC和3%缺氧48 h+VitC 組細胞與正常對照組比較遷移能力無明顯差異(P>0.05)，見圖3～5。

A: 正常對照組

B：3%缺氧組

C：3%缺氧+VitC組

圖33%缺氧24 h組乳腺癌細胞遷移能力

A: 正常對照組

B：3%缺氧組

C：3%缺氧+VitC組

圖43%缺氧48 h組乳腺癌細胞遷移能力

3討論

缺氧是實質性腫瘤局部微環境的基本特征之一。越來越多的研究表明缺氧是決定惡性腫瘤預后的重要因素,缺氧不僅可以促進腫瘤細胞的生長,更重要的是缺氧還可以誘導腫瘤細胞的轉移和浸潤性生長[6-7]，但其機制尚不清楚。

HIF-1是哺乳動物細胞在缺氧條件下產生的一種轉錄因子,主要由HIF-1α、HIF-1β2個亞基組成。

圖5　各組乳腺癌細胞遷移能力比較

正常條件下，各組織HIF-1α的表達甚少，而低氧狀態時，則表現為時間及低氧程度依賴性升高[8]。HIF-1廣泛參與哺乳動物細胞中缺氧誘導產生的特異應答，介導機體的整體和局部缺氧反應，在缺氧誘導的基因表達調節中起著關鍵作用。 研究表明HIF-1α在多種惡性腫瘤,如乳腺癌、卵巢癌等的原發灶、轉移灶、侵襲性癌細胞的前沿部位高表達,拮抗HIF-1α活性可以抑制腫瘤的形成和轉移擴散[9]?；|細胞衍生因子1(stromal cell derived factor-1，SDF-1)屬化學趨化因子超家族，其特異性的受體CXCR4是G蛋白偶聯的7次跨膜受體，目前研究發現CXCR4 在多種腫瘤高表達,并可能在腫瘤發展、轉移中發揮重要的作用[10-11]。本實驗結果表明, 缺氧條件下的MDA-MB-231細胞的增殖能力明顯增加，HIF-1α水平和遷移能力明顯增加,說明缺氧增加MDA-MB-231細胞遷移可能與HIF-1α的表達有關。本研究通過RT-PCR 法從基因水平檢測CXCR4 在乳腺癌細胞的表達,并分析其功能，結果顯示缺氧能上調MDA-MB-231細胞CXCR4表達且增加其的遷移能力,提示缺氧可能與CXCR4表達和乳腺癌遷移能力增加有關。Kim等[7]對79 例手術切除的乳腺浸潤性導管癌組織進行的研究表明, 所有患者的癌組織均表達CXCR4, 而高表達尤其是局灶性高表達者伴有廣泛的淋巴結轉移, 進一步說明CXCR4可能參與乳腺癌的淋巴轉移。

VitC作為抗氧化刺，可以減少自由基的生成,能夠有效拮抗缺氧引起的細胞損傷[12]。為了進一步探討其機制，本研究觀察抗氧化劑VitC對缺氧是否有拮抗作用，結果顯示VitC能夠有效抑制缺氧增加的HIF-1α和CXCR4 mRNA，并能抑制缺氧條件下細胞的遷移能力。說明缺氧可能通過增加乳腺癌細胞缺氧誘導因子HIF-1α表達、CXCR4表達及乳腺癌細胞遷移的遷移能力，為臨床移植乳腺癌轉移提供新的思路和治療靶點。

綜上所述，缺氧能增加細胞的增殖能力，能增加乳腺癌細胞HIF-1α、CXCR4mRNA表達和遷移能力，但能被抗氧化劑VitC有效阻斷，可能為預防乳腺癌轉移提供新的思路。

參考文獻：

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(本文編輯楊晨晨)