肥大細(xì)胞糜蛋白酶在瘢痕疙瘩組織的活性表達(dá)

通信作者：董祥林，男，博士，副主任醫(yī)師，副教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：創(chuàng)面修復(fù)與瘢痕修復(fù)，E-mail：dongxianglin8@126.com。

肥大細(xì)胞糜蛋白酶在瘢痕疙瘩組織的活性表達(dá)

徐濤， 董祥林

(新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院燒傷整形科， 烏魯木齊830054)

摘要：目的探討肥大細(xì)胞糜蛋白酶在人瘢痕疙瘩組織中的表達(dá)活性。方法采用免疫組織化學(xué)法檢測瘢痕疙瘩組織和正常皮膚中肥大細(xì)胞的數(shù)量和糜蛋白酶的表達(dá)，并以RT-PCR和放免法檢測瘢痕疙瘩和正常皮膚組織中糜蛋白酶mRNA表達(dá)活性變化。結(jié)果瘢痕疙瘩組織中肥大細(xì)胞數(shù)量與糜蛋白酶陽性表達(dá)評分為(10±0.25)個/HP、(6.2±0.23) mm2，明顯高于正常皮膚組織的(4±0.22)個/HP、(2.5±0.12)mm2 (P<0.01)；RT-PCR結(jié)果顯示瘢痕疙瘩組織中肥大細(xì)胞mRNA和糜蛋白酶mRNA表達(dá)水平較正常皮膚組織明顯增高。結(jié)論肥大細(xì)胞糜蛋白酶存在于瘢痕疙瘩中且活性表達(dá)明顯高于正常皮膚組織。

關(guān)鍵詞：肥大細(xì)胞糜蛋白酶； 瘢痕疙瘩； 活性表達(dá)

基金項目：新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院青年科研基金(2012QN02)

作者簡介：徐濤(1978-)，男，在讀碩士，研究方向：瘢痕與修復(fù)。

中圖分類號：R34

doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2015.03.013

[收稿日期：2014-09-14]

The expression of mast cells chymase activity in keloid tissue

XU Tao， DONG Xianglin

(DepartmentofBurnsandPlasticSurgery,TheFirstAffiliatedHospitalof

XinjiangMedicalUniversity,Urumqi830054,China)

Abstract:ObjectiveTo explore the expressed activity of mast cells chymase exist in human keloid tissues. MethodsThe number of mast cell and chymase expression in keloid and normal skin were assessed by immunohistochemical methods. Quantitative real-time PCR and Radio immunity method were conducted to measure the change of mRNA expressed activity of chymase in keloid and normal skin tissues. ResultsCompared with normal skin tissue, the number of mast cells and chymase expression were higher in keloid tissues [(10±0.25)/hp vs (4±0.22)/hp, and (6.2±0.23) mm2 vs (2.5±0.12) mm2, P<0.01)]. The results of RT-PCR showed mast cell mRNA expression levels and chymase mRNA level were also significantly higher in keloid tissues than those of normal skin tissues (P<0.05). ConclusionThe chymase of mast cells exists in keloids and the expressed activity of chymase is statistically higher than those of normal skin tissues.

Key words： keloid; mast cells chymase； activity

瘢痕疙瘩是一種慢性炎癥性纖維化疾病，其與眾不同的組織學(xué)特征就是異常增多的細(xì)胞外基質(zhì)、局部包括肥大細(xì)胞在內(nèi)的炎癥細(xì)胞浸潤以及大量的細(xì)胞因子聚集[1]。瘢痕疙瘩的炎癥部分常表現(xiàn)顏色發(fā)紅、血管過度增生和高滲透性伴有包括肥大細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的高浸潤炎癥細(xì)胞[2]。肥大細(xì)胞不僅被認(rèn)為是皮膚過敏性炎癥反應(yīng)的主要細(xì)胞，而且在皮膚傷口異常愈合過程中其數(shù)量和質(zhì)量發(fā)生了明顯變化[3]，表明肥大細(xì)胞與其他介質(zhì)在病理性瘢痕發(fā)病中發(fā)揮了重要的作用[4]。

目前關(guān)于肥大細(xì)胞在瘢痕疙瘩的發(fā)病中起何作用還不清楚。但是肥大細(xì)胞活化后脫顆粒釋放組胺、肝素和各種酶類如糜蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、組織蛋白酶G和羥基肽酶A等[5]， 在這些中性蛋白酶中，糜蛋白酶與組織纖維化密切相關(guān)。糜蛋白酶是α-糜蛋白酶-絲氨酸類蛋白酶(CLP)，最初發(fā)現(xiàn)存在于肥大細(xì)胞，后來發(fā)現(xiàn)也存在于人的心臟和血管組織中[6]。糜蛋白酶涉及許多生理和病理生理過程，糜蛋白酶最重要的功能之一就是調(diào)節(jié)AngII的生成，已經(jīng)被證實人的心臟糜蛋白酶是一種主要的非ACE的AngII形成酶。此外糜蛋白酶可促進(jìn)心肌、皮膚等成纖維細(xì)胞增殖[7-8]；促使細(xì)胞外基質(zhì)綁定的TGF-β1釋放[9]；使溶膠原蛋白降解而參予組織塑形；并且參與炎癥反應(yīng)[10]。免疫組化顯示CD117(C-Kit)是肥大細(xì)胞表面調(diào)控其功能的重要受體[11-12]，其強(qiáng)烈的膜染色被認(rèn)為存在于正常肥大細(xì)胞和所有肥大細(xì)胞疾病的肥大細(xì)胞上，主要分布在纖維化增生區(qū)，在表皮也可見糜蛋白酶標(biāo)記的肥大細(xì)胞[13]。可見肥大細(xì)胞以及糜蛋白酶均存在于瘢痕疙瘩組織中且肥大細(xì)胞于瘢痕疙瘩中激活脫顆粒釋放糜蛋白酶，發(fā)揮著活性作用。

來源于肥大細(xì)胞的糜蛋白酶與組織纖維化密切相關(guān)，研究表明肥大細(xì)胞存在于瘢痕疙瘩中且與其他介質(zhì)在瘢痕疙瘩的形成中可能起到作用[4]。本研究通過對比研究正常皮膚和瘢痕疙瘩組織中肥大細(xì)胞糜蛋白酶基因和活性表達(dá)，探討其是否存在于瘢痕疙瘩中及其活性表達(dá)情況，為進(jìn)一步研究其在瘢痕疙瘩中的作用提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1實驗標(biāo)本新鮮的瘢痕疙瘩和正常皮膚的組織標(biāo)本來自于2011年10月-2012年9月在新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院整形外科因瘢痕疙瘩手術(shù)切除的瘢痕組織標(biāo)本和其他手術(shù)的患者。其中瘢痕疙瘩10例，男性4例，女性6例；瘢痕部位：胸前4例，肩部3例，手腕部1例，耳垂2例。用于對照的正常皮膚10例，男性6例，女性4例;取自腋臭、痣行手術(shù)切除的皮膚組織，瘢痕切除后體表畸形需要修復(fù)重建的患者。由2名進(jìn)行修復(fù)重建的整形外科醫(yī)生選擇患者?；颊呤中g(shù)前均未使用激素及免疫抑制劑治療，局部亦未行放射治療。標(biāo)本離體后分為兩部分：一部分立即液氮轉(zhuǎn)移至-70℃冰箱保存；另一部分立即行多聚甲醛固定，梯度酒精脫水，二甲苯透明，浸蠟包埋、制片。所用器械、容器均經(jīng)清潔后采用0.1% DEPC水處理，并高壓消毒。

本研究經(jīng)過新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會同意并和受試者簽署了知情同意書。每個瘢痕疙瘩組織都被切取一小塊送病理實驗室進(jìn)行組織化學(xué)檢查以進(jìn)一步確認(rèn)臨床診斷的正確性。

1.2主要試劑多克隆兔抗人CD117(C-Kit)抗體、鼠抗糜蛋白酶多克隆抗體(購自Gene Company Limited 基因有限公司)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，實時定量PCR試劑盒(購自美國Bio-Rad公司)，放免試劑盒(購自北京北方生物技術(shù)研究所)。

1.3方法

1.3.1肥大細(xì)胞和肥大細(xì)胞糜蛋白酶免疫組化和肥大細(xì)胞糜蛋白酶化染色肥大細(xì)胞和肥大細(xì)胞糜蛋白酶染色分別采用多克隆兔抗人CD117(C-Kit)抗體和鼠抗糜蛋白酶多克隆抗體作為一抗進(jìn)行免疫組化染色。應(yīng)用免疫組織化學(xué)EliVision二步法[14]對瘢痕疙瘩和正常皮膚組織石蠟切片進(jìn)行CD117抗體和糜蛋白酶抗體檢測，觀察CD117和糜蛋白酶表達(dá)，其中一抗用抗體稀釋液按1∶500稀釋，二抗為抗兔Envision抗體。CD117、糜蛋白酶陽性部位為細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)，光鏡觀察結(jié)果以細(xì)胞膜和細(xì)胞漿著棕色者為陽性染色，另用PBS代替一抗為陰性對照。結(jié)果判定：(1)CD117染色后可見肥大細(xì)胞膜呈棕黃色表現(xiàn)，檢測每例切片隨機(jī)5個高倍鏡視野CD117染色的肥大細(xì)胞數(shù)，取其平均數(shù)/高倍視野。(2)肥大細(xì)胞糜蛋白酶染色后可見細(xì)胞漿呈淺棕褐色陽性表達(dá)。肥大細(xì)胞糜蛋白酶免疫組織化學(xué)半定量分析方法：在光鏡下觀察，根據(jù)染色的反應(yīng)強(qiáng)度及著色面積判斷結(jié)果：每張切片陽性細(xì)胞的陽性強(qiáng)度：無著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。著色陽性面積：無著色為0分，著色面積<1/3為1分，1/3～2/3為2分，>2/3為3分。根據(jù)評分標(biāo)準(zhǔn)≥3分為陽性[15]。

1.3.2瘢痕疙瘩和正常皮膚組織的肥大細(xì)胞糜蛋白酶實時定量PCR將正常皮膚及瘢痕疙瘩組織解凍后剪碎至0.2～0.8 mm大小，用玻璃勻漿器將其壓成勻漿，提取總RNA(Trizol試劑，Invitrogen公司，美國)，從總RNA中取2 μg DNA，按照AMV逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒(Promega，WI，USA)說明書進(jìn)行操作。按照SYBR Premix Ex Taq kit (Takara)操作說明書，在IQ5實時PCR系統(tǒng)(Bio-Rad)進(jìn)行實時定量PCR擴(kuò)增。實時PCR反應(yīng)體系容量為20 μL。實驗方案：初始變性30 s 95℃；5 s 95℃， 30 s 55℃共40個循環(huán)，60 s 72℃；溶解曲線溫度65℃～95℃。使用2△△CT方法計算初始規(guī)范肥大細(xì)胞糜蛋白酶對GAPDH的相對基因表達(dá)。肥大細(xì)胞糜蛋白酶和GAPDH特異性引物序列如下： F:5′-CTG AGA GGA TGC TTC TTC CTG C-3′, R: 5′-AGA TCT TAT TGA TCC AGG GCC G-3′。GAPDH引物序列：F： 5′-AAC TCC ATC ATG AAG TGT GA-3′, R: 5′-ACT CCT GCT TGC TGA TCC AC-3′。所有樣品實時定量PCR實驗重復(fù)3次。

1.3.3瘢痕疙瘩和正常皮膚組織的肥大細(xì)胞糜蛋白酶活性檢測取100 mg組織反復(fù)勻漿后放入(10 w/v)50 mmol/L NaH-2PO-4緩沖液(pH/7.4)，4℃靜置15 min。4℃、9 000 r/min離心20 s，棄上清。將沉渣轉(zhuǎn)移至50 mmol/L NaH-2PO-4 緩沖液中超聲勻漿(設(shè)置為400安培，5 s/次，間隙10 s，反復(fù)3～5次)。勻漿組織在4℃、30 000 g離心20 min。重復(fù)上述勻漿與離心過程3遍，分別收集3次的上清(糜酶存在于上清液中)。分別取出經(jīng)過上述處理的每個待測樣品懸浮液1 500 μL，分成3管，每管500 μL，分別編號為A、B、C。反應(yīng)體系如下:(1)反應(yīng)體系A(chǔ)，加入6 ng AngI(血管緊張素I );(2)反應(yīng)體系B，加入6 ng AngI和 50 μM賴諾普利;(3)反應(yīng)體系C，加入6 ng AngI和20 μmol/L抑肽酶。置于37℃水浴15 min后，加入2.5倍體積預(yù)冷乙醇終止反應(yīng)。按照放射免疫分析藥盒說明書測定各樣品的AngII含量。以每分鐘每100 mg皮膚組織中生成 1 nmol AngII所需的酶活力量定義為1個酶活力單位(U)。ACE(血管緊張素轉(zhuǎn)化酶)活性=應(yīng)體系A(chǔ)的酶活性-反應(yīng)體系B的活性；其他絲氨酸蛋白酶活性=反應(yīng)體系A(chǔ)的酶活性-反應(yīng)體系C的活性；肥大細(xì)胞糜蛋白酶的活性=應(yīng)體系A(chǔ)的酶活性-ACE活性-其他絲氨酸蛋白酶活性。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，根據(jù)方差齊性，樣本間兩兩比較采用q檢驗和秩和檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1肥大細(xì)胞CD117和肥大細(xì)胞糜蛋白酶免疫組化染色光鏡下觀察：瘢痕疙瘩組織切片可見纖維濃密，方向不規(guī)則，呈旋渦狀，在纖維間還可見多個與成纖維細(xì)胞相鄰的含有豐富胞質(zhì)顆粒的肥大細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)圓形、橢圓形及不規(guī)則形。其胞質(zhì)顆粒密度不均勻，一些細(xì)胞顆粒密度降低，表明肥大細(xì)胞有脫顆粒。CD117(C-Kit)免疫組化染色后肥大細(xì)胞膜呈棕黃色。瘢痕疙瘩組織塊中細(xì)胞膜被染成棕黃色肥大細(xì)胞的數(shù)量(圖1A)以及細(xì)胞漿中淺棕褐色顆粒染色(肥大細(xì)胞糜蛋白酶染色,圖1B)明顯多于正常皮膚組織(圖1C、1D和表1 )，肥大細(xì)胞糜蛋白酶染色呈強(qiáng)陽性表達(dá)。

表1　瘢痕疙瘩組織和正常皮膚組織肥大細(xì)胞比較( ±s)

表1　瘢痕疙瘩組織和正常皮膚組織肥大細(xì)胞比較( ±s)

n肥大細(xì)胞數(shù)/(個/HP)肥大細(xì)胞糜蛋白酶/mm+2瘢痕疙瘩1010.00±0.256.20±0.23正常皮膚104.00±0.222.50±0.12

注：與正常皮膚組織比較，*P<0.05。

A: 肥大細(xì)胞CD117在早期瘢痕疙瘩組織中的表達(dá)(400×)

B: 肥大細(xì)胞糜蛋白酶在早期瘢痕疙瘩組織中表達(dá)呈強(qiáng)陽性(400×)

C: 肥大細(xì)胞CD117在正常皮膚中的表達(dá)(400×)

D: 肥大細(xì)胞糜蛋白酶在正常皮膚中的表達(dá)(400×)

圖1肥大細(xì)胞CD117和肥大細(xì)胞糜蛋白酶在瘢痕疙瘩及正常皮膚中的表達(dá)

2.2糜蛋白酶的實時定量PCR 分析及其活性變化瘢痕疙瘩組織中肥大細(xì)胞糜蛋白酶mRNA表達(dá)水平明顯高于正常皮膚(圖2)，瘢痕疙瘩組織中糜蛋白酶活性表達(dá)較正常皮膚明顯增強(qiáng)(圖3),差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

3討論

肥大細(xì)胞糜蛋白酶在瘢痕疙瘩中是否有活性表達(dá)還不清楚。目前肥大細(xì)胞糜蛋白酶的表達(dá)檢測主要有基因檢測和活性檢測。Chen等[16]運用逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測倉鼠心力衰竭模型的心肌糜蛋白酶mRNA表達(dá)。Guo等[17]運用逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測卵白蛋白激發(fā)的倉鼠動脈粥樣硬化糜蛋白酶mRNA表達(dá)。Matsumoto等[18]運用定量PCR檢測糜蛋白酶抑制劑SUNC8257作用于心動過速誘導(dǎo)的狗心力衰竭糜蛋白酶mRNA表達(dá)。糜蛋白酶活性的檢測方法尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，國際上較多采用組織提取物加入含AngI的反應(yīng)體系，應(yīng)用HPLC檢測糜酶活性，但測量誤差較大。國內(nèi)學(xué)者采用改良AngI反應(yīng)體系，采用3種抑制劑分別抑制糜酶以外其他AngI水解酶活性，運用減法原則和放射免疫技術(shù)檢測AngII水解活性來表示糜酶活性，理論上較為合理[19]。

圖2　瘢痕肥大細(xì)胞糜蛋白酶基因表達(dá)

圖3　肥大細(xì)胞糜蛋白酶活性表達(dá)

本研究顯示瘢痕疙瘩中的肥大細(xì)胞數(shù)量明顯多于正常皮膚，肥大細(xì)胞糜蛋白酶的免疫組化染色也表明瘢痕疙瘩中肥大細(xì)胞糜蛋白酶呈強(qiáng)陽性表達(dá)；瘢痕疙瘩組織中肥大細(xì)胞數(shù)量與糜蛋白酶陽性表達(dá)評分為(10±0.25)個/HP、(6.2±0.23)mm2，明顯高于正常皮膚組織(4±0.22)個/HP、(2.5±0.12)mm2(P<0.01)；RT-PCR結(jié)果顯示瘢痕疙瘩組織中肥大細(xì)胞mRNA和糜蛋白酶mRNA表達(dá)水平較正常皮膚明顯增高,表明糜蛋白酶活性在瘢痕疙瘩中明顯高于正常組織。肥大細(xì)胞主要分布于纖維組織增生區(qū)。瘢痕疙瘩組織中糜蛋白酶濃度高的患者，其肥大細(xì)胞分布也增多，提示瘢痕疙瘩中糜蛋白酶濃度與纖維化關(guān)系密切。

瘢痕組織病理學(xué)表現(xiàn)均是以成纖維細(xì)胞增生和膠原為主的細(xì)胞外基質(zhì)成分的過度積聚為特征。成纖維細(xì)胞是瘢痕組織的效應(yīng)細(xì)胞，具有增殖及膠原合成功能，對細(xì)胞因子的反應(yīng)性和細(xì)胞骨架改變等表型特征可能是受某些基因或細(xì)胞因子調(diào)控的。本研究結(jié)果顯示，在瘢痕疙瘩組織中糜蛋白酶活性明顯高于正常皮膚組織，提示瘢痕疙瘩中糜蛋白酶在創(chuàng)口愈合的纖維化中起重要作用。

肥大細(xì)胞的數(shù)量變化以及糜蛋白酶在皮膚創(chuàng)面的異常愈合過程中有著重要的作用，本實驗進(jìn)一步表明肥大細(xì)胞活化脫顆粒釋放的肥大細(xì)胞糜蛋白酶可能在創(chuàng)面的異常愈合中起到一定的作用?？梢栽O(shè)想，通過特異干預(yù)肥大細(xì)胞糜蛋白酶的表達(dá)，必定對核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生影響。另外，干預(yù)肥大細(xì)胞糜蛋白酶與其他細(xì)胞因子的結(jié)合，也將會對細(xì)胞功能產(chǎn)生一定影響,減少瘢痕疙瘩的產(chǎn)生。

綜上所述，肥大細(xì)胞糜蛋白酶存在于瘢痕疙瘩中且活性表達(dá)明顯高于正常皮膚組織，并參與瘢痕疙瘩的形成，但是其對瘢痕疙瘩形成的相關(guān)性還需要進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：

[1]李惠斌,蔡景龍.瘢痕疙瘩治療研究進(jìn)展[J].中華醫(yī)學(xué)美學(xué)美容雜志,2004,10(2):126-128.

[2]柳大烈,張選奮,魯開化,等.增生性瘢痕和瘢痕疙瘩中PTK活性測定[J].中華醫(yī)學(xué)美學(xué)美容雜志,2001,7(2):83-85.

[3]McNeil HP.The mast cell and inflammation[J].Aust N Z J Med, 1996 ,26(2):216-225.

[4]Lee YS, Vijayasingam S.Mast cells and myofibroblasts in keloid:a light microscopic, immunohistochemical andultrastructural study[J].Ann Acad Med Singapore,1995 ,24(6):902-905.

[5]Kovanen PT. Mast cells:multipotent local effector cells in atherothrombosis[J].Immunol Rev, 2007,217:105-122.

[6]Richard V, Hurel-Merle S, Scalbert E, et al. Functional evidence for a role of vascular chymase in the production of angiotensin II in isolated human arteries[J]. Circulation, 2001,104(7):750-752.

[7]Zhao LZ, Zheng JS, Guan FS, et al. Chymase induces profibrotic response via transforming growth factor-β1/Smad activation in rat cardiac fibroblasts[J].Mol Cell Biol, 2008,310(1-2):159-166.

[8]Maruichi M, Takai S, Sugiyama T, et al. Role of chymase on growth of cultured canine Tenon′s capsule fibroblasts and scarring in a canine conjunctival flap model[J]. Exp Eye Res, 2004,79(1):111-118.

[9]梁秀影,李健寧.增生性瘢痕中肥大細(xì)胞類胰蛋白酶的表達(dá)[J].中華醫(yī)學(xué)美學(xué)美容雜志, 2007,13(6):345-347.

[10]Doggrell SA, Wanstall JC. Vascular chymase:pathophysiological role and therapeutic potential of inhibition[J]. Cardiovasc Res, 2004,61(4):653-662.

[11]El-Agamy DS.Targetingc-kit in the therapy of mast cell disorders:current update[J].Eur J Pharmacol, 2012,690(3):1-3.

[12]Ray P，Krishnamoorthy N，Oriss TB，et al．Signaling of c-kit in dendritic cells influences adaptive immunity [J]．Ann NY Acad Sci，2010，1183(5)：104-122．

[13]Natkunam Y, Rouse RV.Utility of paraffin section immunohistochemistry for C-KIT (CD117) in the differentialdiagnosis of systemic mast cell disease involving the bone marrow[J].Am J Surg Pathol, 2000 ,24(1):81-91.

[14]Vosse BA,Seelentag W,Bachmann A,et al.Background staining of visualization systems in immunohistochemistry: comparison of the Avidin-Biotin Complex system and the EnVision+system[J]. Appl Immunohistochem Mol Morphol,2007,15(1):103-107.

[15]趙雪蓮,蘇曉光,張錘,等.兔耳病理性瘢痕皮回植術(shù)后組織中基質(zhì)金屬蛋白酶-1及金屬蛋白酶組織抑制劑-1表達(dá)的變化[J].中華醫(yī)學(xué)美學(xué)美容雜志,2014，20(1)：62-64.

[16]Pengmin C. Changes of chymase, angiotensin converting enzyme and angiotensin Ⅱ type 1 receptor expressions in the hamster heart during the development of heart failure[J]. Chinese Med J, 2005,22:1886-1892.

[17]Guo T, Chen WQ, Zhang C, et al. Chymase activity is closely related with plaque vulnerability in a hamster model of atherosclerosis[J]. Atherosclerosis. 2009,207(1):59-67.

[18]Matsumoto T, Wada A, Tsutamoto T, et al. Chymase inhibition prevents cardiac fibrosis and improves diastolic dysfunction in the progression of heart failure[J]. Circulation,2003, 107(20):2555-2558.

[19]Luchner A, Stevens TL, Borgeson DD, et al. Angiotensin Ⅱ in the evolution of experimental heart failure[J].Hypertension,1996, 28(3):472-477.

(本文編輯張巧蓮)