大鼠肝泡球蚴病模型早期超聲造影表現與病理對照分析

通信作者：劉文亞，女，主任醫師，教授， 博士生導師， 研究方向： 腹部疾病及包蟲病的多模態影像學診斷， E-mail：dr_lwyykdx@163.com。

大鼠肝泡球蚴病模型早期超聲造影表現與病理對照分析

曾紅春1， 王靜2， 劉文亞2， 王穎鑫1， 王俊華3

(新疆醫科大學第一附屬醫院1超聲診斷科，2影像中心，3基礎醫學和包蟲病研究所， 烏魯木齊830011)

摘要:目的探討超聲造影揭示早期大鼠肝泡球蚴病灶血流灌注的價值。方法開腹直視下肝內感染泡球蚴9 w的33只大鼠，進行常規超聲、超聲造影檢查，詳細記錄不同檢查方法的影像特征，并與病理對照。結果常規超聲和超聲造影篩查早期大鼠肝泡球蚴病灶的敏感性分別為91.67%和81.82%。超聲表現主要表現為高回聲型(29/33,87.88%)和混合性回聲(4/33,12.12%)，經病理證實所有病灶均表現為單個或多個囊泡樣結構。33個病灶彩色多普勒超聲均未顯示血流信號，14個病灶(14/30,46.67%)超聲造影顯示為動脈期環狀強化，14個病灶(14/30,46.67%)顯示動脈期及門脈期環狀強化伴內部分隔強化，2個病灶(2/30,6.66%)未見明顯強化。超聲造影顯示的增強區域，經病理證實為泡球蚴病灶周邊富含微血管的炎性反應帶。結論常規超聲在篩查大鼠肝泡球蚴病中，較超聲造影具有較高的靈敏度，然而，超聲造影可以顯示病灶內部的囊泡和病灶內部及周邊的血流灌注情況。

關鍵詞：泡球蚴； 肝臟； 超聲

基金項目：新疆維吾爾自治區自然科學基金(2014211C039)

作者簡介：曾紅春(1977-)，女，博士，副主任醫師，副教授 ，碩士生導師，研究方向：淺表及腹部器官疾病的超聲診斷，包蟲病的影像學診斷。

中圖分類號：R445.1

doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2015.03.015

[收稿日期：2014-06-03]

Contrastive analysis of contrast-enhanced ultrasonography in assessing

early infection stage in rat with hepatic alveolar echinococcosis

ZENG Hongchun1, WANG Jing2, LIU Wenya2, WANG Yingxing1, WANG Junhua3

(1DepartmentofUltrasonography,2ImagingCenter,3XinjiangKeyLabofFundamental

MedicalResearchandXinjiangHydatidClinicalResearchInstitute，TheFirstAffiliatedHospital

ofXinjiangMedicalUniversity,Urumqi830011,China)

Abstract:ObjectiveTo assess the effectiveness of Contrast-enhanced ultrasonography (CEUS) in screening for hepatic alveolar echinococcosis (HAE) at early infection stage in rat model. Methods33 rats were intraheptacilly infected with E. mutilocularis, Utrasonography (US) and CEUS features of HAE lesions were recorded after 9 weeks post infection, compared with pathology, and the accuracy and effectiveness of US and CEUS were assessed according to the principle of diagnostic test. ResultsUS and CEUS had a high sensitivity of 91.67% and 81.82% in screening the early HAE in rats. The typical ultrasonographic features of HAE lesions were hyper-echoic(29/33,87.88%), and 4 lesions presented mixed pattern (4/33,12.12%). Single or multiple milky white or beige cyst-like nodules containing fluid were observed in the liver by using pathological examination. Hematoxylin-eosin (HE) staining showed that the small cyst was surrounded by the characteristically proliferated small blood vessels and infiltrated inflammatory cells. CDFI failed to detect blood flow signals in 33 lesions. CEUS results for 14 lesions (14/30,46.7%) showed ring enhancement in the peripheral area during the arterial phase and no filling effect in either the portal or the delayed phase and ring enhancement combined with central septa enhancement during the arterial phase and portal venous phase (14/30,46.7), and no enhancement in 2 lesions (2/30,6.6%). The enhanced area, confirmed by pathologic examination, was an inflammatory reaction belt surrounding the lesion. ConclusionThis study suggests that US, with higher sensitivity, can be recognized as a screening method for early HAE lesions in the animal model, while CEUS can be used for displaying the peripheral and internal blood perfusion.

Key words: Alveolar echinococcosis; hepatic; contrast-enhanced ultrasonography

肝泡球蚴病(Hepatic Alveolar Echinococcosis, HAE)由多房棘球絳蟲感染、以小囊泡增殖的方式逐漸侵蝕周圍組織及血管[1]，具有類似惡性腫瘤的生物學方式。在該病的臨床診斷中，影像學(超聲、CT、MRI)常被作為常用的檢查方法，其典型表現已有報道[2-4]，由于該病病理演變復雜多變，單憑傳統影像學進行早期診斷仍存在困難[5-6]。鑒于該病具有嚴重致病性，如未經及時治療，病死率可高達90%。因此，尋求一種新的方法，作為早期診斷的補充，具有非常重要的臨床意義。本研究通過建立大鼠感染肝泡球蚴早期階段的動物模型，運用超聲造影觀察早期大鼠肝泡球蚴病灶的血流灌注模式，旨在確定血管化特征在早期肝泡球蚴病灶中的診斷價值，以期為該病提供早期診斷的客觀依據。

1材料與方法

該研究已獲新疆醫科大學第一附屬醫院倫理委員會審查通過(批準號：20110224001)。

1.1實驗動物選用新疆醫科大學動物實驗中心飼養的50只雌性SD大鼠，體質量(200±20) g。種鼠由新疆醫科大學第一附屬醫院動物實驗科學部提供。

1.2動物模型的制備無菌條件下，快速處死種鼠，剖腹取出新鮮泡狀棘球蚴組織，去除多余的壞死組織。將余留的組織進行稱重、剪刀剪碎、研磨器碾磨、細紗布過篩，制成細小組織勻漿。然后用0.9%生理鹽水反復沖洗、沉淀，重復3～6次，將壞死組織及血細胞成分濾去。最后，剩余組織加適量的無菌生理鹽水制成濃度為20%(20 000 個原頭節/mL)的溶液，在溶液內加入適量青霉素和鏈霉素注射液進行除菌，藥物濃度為250 U/mL，接種留用。開腹切口約0.5 cm，直視下選取大鼠肝臟較厚的肝左葉穿刺，注射器針頭斜行進針，入肝實質內約1 cm 左右，注入20%原頭節混懸液0.1 mL，紗布壓迫止血，絲線逐層縫合關閉腹腔。

1.3超聲造影檢查接種后9 w，45只大鼠存活，超聲篩查33只大鼠接種成功。檢查儀器為Acuson Sequia 512(8～14 MHz)，選用CPS模式，機械指數為0.08～0.11，針對不同病灶調試增益、掃面范圍和增益控制，注入造影劑后每次檢查持續時間為5 min。造影劑為聲諾維(SonoVue，意大利，博萊克公司)，主要成分為六氟化硫微泡。使用前注入5 mL 0.9%生理鹽水，搖勻，配置成混懸液，留置備用。每只大鼠從尾靜脈注入0.5 mL造影劑混懸液，隨即用2 mL生理鹽水進行沖管。

參照臨床研究肝臟造影的各時相增強時間，動脈期定義為肝動脈開始顯影的時期，此時周圍肝組織仍然為低回聲；門靜脈期為肝內門靜脈開始顯影，同時肝實質開始增強，此時肝動脈的造影劑增強開始減低；肝實質增強減低時為延遲相，此期肝實質回聲減退。所有的檢查結果均儲存在工作站內(藍韻公司，深圳，中國)。造影增強模式：僅有周邊增強無內部增強為環狀強化；周邊及內部同時增強，為環狀增強伴內部分隔增強。

1.4圖像解釋和分析所有的影像資料由兩名影像科醫生進行評價，評價內容包括病灶數目，內部回聲、病灶的最大直徑，病灶增強模式。依據病灶的超聲表現和大小，將圖像分為兩種類型：高回聲型：表現為點狀高回聲、簇狀細小高回聲、灶狀高回聲；混合回聲型：病灶內部呈高回聲伴圓形/類圓形無回聲至極低回聲。

1.5病理組織學檢查超聲造影檢查結束后，采用頸椎離斷的方法快速處死大鼠，剖腹取出肝臟組織，觀察病灶的大體，測量大小及形態，留取資料圖。按取材要求切取標本，10%甲醛固定、脫水、透明、石蠟包埋、切薄片(厚約5 μm)，進行HE染色、Masson染色、免疫組化染色。

1.6統計學分析采用SPSS13.0 統計軟件，所有的病灶直徑采用計量資料的方式進行記錄，比較超聲造影和常規超聲測量病灶直徑是否有差異用配對t檢驗的方法，檢驗標準α=0.05 。超聲造影檢查和常規超聲在肝泡球蚴病灶中的靈敏度和特異度用RevMan 5.0軟件進行分析。

2結果

2.1大鼠肝泡球蚴病灶常規超聲及彩色多普勒超聲表現經超聲檢查共檢出30只大鼠感染成功，共33個病灶。28只大鼠肝內有1個病灶，1只大鼠有2個病灶，1只有3個病變。超聲測量最大病灶直徑16 mm，最小病灶直徑1 mm。3個病灶因直徑<1 mm不能被超聲所顯示。超聲篩查大鼠肝泡球蚴病灶的敏感性和特異性分別為91.67%和100%。29個病灶(29/33，87.9%)表現為高回聲型(圖 1)，4個病灶(4/33, 12.1%)表現為混合性回聲(圖 2)，所有的病灶內部均未見血流信號。

2.2大鼠肝泡球蚴病灶的超聲造影檢查超聲造影檢出27只大鼠感染成功，共30個病灶。病灶最大直徑18 mm，最小直徑2.5 mm。6只大鼠共6個病灶，由于直徑<2 mm無法被超聲造影所發現。超聲造影的敏感性和特異性分別為81.82%和 100%。 超聲造影測量的病灶直徑為 (5.18±0.58) mm，稍大于常規超聲測量的病灶直徑(4.39±0.48) mm，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.3大鼠肝泡球蚴病灶不同超聲造影增強模式與病灶直徑、超聲表現的關系環狀增強模式(14/30, 46.67%) 10個病灶直徑≤3 mm，在常規超聲上表現為點狀高回聲，4個病灶(3～6 mm)常規超聲表現為密集點狀高回聲。超聲造影表現為動脈期環狀強化，內部無強化，門靜脈早期出現廓清，中央始終無增強(圖 3)。環狀強化伴中央分隔增強(14/30，46.67%) 10個病灶(3～6 mm)常規超聲表現為灶狀高回聲，4個直徑≥7 mm的病灶超聲表現為肝內邊界清晰的混合性病灶，內呈高回聲伴無回聲及低回聲。超聲造影表現為動脈期及門脈期環狀強化伴中央分隔增強(圖 4)。無增強(2/30,6.66%) 病灶直徑<2 mm，超聲造影各時期均未見增強，與肝實質強度一致。

圖1肝內可見高回聲病灶(箭頭)

圖2肝內混合性病灶(箭頭)其內可見類圓形囊泡

圖3肝內高回聲灶超聲造影呈環狀增強(箭頭)

圖4肝內混合回聲灶(箭頭)呈內部分隔增強

2.4大鼠肝泡球蚴病灶不同增強模式與病理對照超聲造影表現為環狀強化的病灶(10/30,33.33%)經病理證實為單個米黃色或乳白色囊泡樣結構(圖 5)，囊內含少量黏液及乳白色物質，HE染色表現為中央紅染囊泡樣結構，周邊可見與正常肝組織分界不清的環狀炎性反應帶(圖 6)，其內含肉芽組織、纖維組織、以及小血管結構，其間可見上皮細胞，巨噬細胞，成纖維細胞和淋巴細胞。Masson染色可清晰顯示藍染的纖維結構(圖 7)。

超聲造影表現為環狀強化伴分隔強化的14個病灶(14/30,46.67%)及4個環狀增強的病灶(4/30,13.33%)，經病理證實為乳白色多囊泡樣結構，囊內含較多量黏液及乳白色物質。在HE染色上表現為多個紅染的囊泡樣結構，內壁可見細小芽生囊泡結構(圖 8)，各囊泡結構間及整個病灶周邊可見寬窄不一的炎性反應帶。2個未顯示強化的病灶(2/30,6.67%)在病理表現為單個囊泡樣結構，HE染色可見體積較小的紅染結構，周邊不伴明顯的炎性反應區。

圖5乳白色囊泡結構外突于肝臟(箭頭)

圖6HE染色示病灶周邊炎性反應區(箭頭)

圖7Masson染色藍染部分為纖維組織(箭頭)

圖8HE染色多囊泡樣結構伴芽生組織(箭頭)

3討論

多房棘球蚴由大小不一(直徑1～10 mm)的小囊泡集聚而成，在宿主組織內通過外生性出芽增殖方式呈浸潤性緩慢生長。該病的早期診斷是提高治愈率的關鍵。早期由于受成像技術的限制，影像學很難顯示病灶內部的囊泡樣結構。近幾年，部分學者[7-8]通過運用MR技術成功顯示病灶內部多囊泡結構，并證實病灶呈多囊泡樣表現是肝泡球蚴生長的早期階段，為采用影像學診斷肝泡球蚴病灶提供了影像學依據。本研究建立肝泡球蚴早期感染階段的大鼠動物模型，擬模擬肝泡球蚴病灶的早期階段，所有病灶均經病理證實為單個或多個囊泡樣結構，因而，本研究采用接種后9 w的大鼠肝泡球蚴模型，作為肝泡球蚴病早期階段的研究是有理論依據的。

直徑較小(≤3 mm)的病灶，主要表現為動脈期環狀強化，內部無強化，類似增強方式在人類肝泡球蚴病灶[9]及腦泡球蚴[10]中均見報道。王靜等[11]通過CT灌注技術反映病灶的血管化狀態，提出泡球蚴周邊的高灌注區域與泡球蚴的活性狀態有密切關系，此區域在病理上表現為富含微血管及炎性細胞的環狀區域。本研究采用的聲諾維造影劑可反映病灶的微血流灌注[12]，因此，超聲造影顯示的環狀增強區為大鼠泡球蚴病灶周緣的炎性反應區。

直徑較大的病灶(≥5 mm)表現為動脈期和門靜脈期病灶周邊環狀強化伴內部分隔強化。此型病灶在病理上均呈現為多囊泡樣結構，病灶周緣及部分囊泡結構周緣均可見類似小病灶周邊的炎性反應區。病灶的直徑不同，呈現了不同的增強模式，該結果表明直徑較小病灶的血供主要是來自肝動脈，隨著病灶的逐漸增大，小動脈進行性破壞，周邊的門靜脈逐漸參與供血，因而，直徑較大的病灶中出現門靜脈期增強的特征。

有學者報道超聲表現為高回聲伴極低或無回聲區的泡球蚴病灶，處于肝泡球蚴病灶生長階段的較早期[9]。但上述病灶未經過病理證實，本研究觀察33個大鼠肝泡球蚴病灶感染早期階段的超聲表現，經病理證實均為含液性成分的囊泡樣結構。依照超聲成像原理，囊性結構在超聲上應表現無回聲或極低回聲。然而，本研究中大多數病灶(29/33，87.9%)表現為高回聲，分析原因主要是由于小病灶內部液性成分較少，且周邊被較厚的纖維組織結構包裹，在超聲上形成強反射，因而超聲現象為高回聲灶。隨著病灶的逐漸增大，囊泡內液性成分亦增多，囊性結構才可被超聲所顯示。

本研究中生長周期相同的肝泡球蚴病灶，病灶的大小及內部結構表現不同，分析原因可能是由于不同個體對泡球蚴組織的免疫反應不同。該現象表明泡球蚴組織在肝內的初始生長方式可以是單個囊泡樣結構，也可是多個囊泡樣結構。2個直徑<2 mm的病灶在各期均未增強，經病理證實病灶周邊無明顯的炎性反應帶，因此超聲造影后增強特征不明顯。肝泡球蚴病灶大小的準確測量，對于動態評價治療效果非常重要。常規超聲由于不能準確顯示病灶的邊緣，因此不能準確反映病灶的大小。本研究中，所有病灶經超聲造影測量的結果都比常規超聲大，分析原因可能是由于超聲造影可顯示病灶周邊的炎性反應區。

總之，常規超聲在篩查肝泡球蚴病中，較超聲造影具有較高的靈敏度，然而，超聲造影可以顯示更為詳細的內部結構，尤其是病灶內部的囊泡和病灶周邊的血流灌注區。因此，超聲造影可作為診斷超聲表現不典型的肝泡球蚴病灶的一種補充檢查方法。

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(本文編輯張巧蓮)