抗稻瘟病基因定位與克隆及其在分子育種上的應用

◎王 丹，肖應輝

（湖南農業大學農學院，湖南 長沙 410128）

水稻（Oryza sativa）作為世界上主要的糧食作物之一，它的生產關系糧食安全。稻瘟病是由真菌病原物Magnaporthe oryzae引起的，是水稻最嚴重的病害之一，嚴重威脅著世界的糧食生產[1]。據統計，從1975～1990年間，全世界由稻瘟病導致的水稻產量損失高達1.57 億噸[2]。自20世紀末以來，我國稻瘟病每年發生面積均超過380 萬hm2，所造成的產量損失達數億公斤每年[3]。實踐證明，控制此病害最經濟、有效和環保的方法是利用寄主的抗性培育和種植抗病品種[1,4]，而應用分子標記輔助選擇（marker-assisted selection，MAS）技術將多個具有不同抗譜的稻瘟病抗性基因聚合到同一個品種中，是培育具有持久抗瘟性品種的有效措施之一[5]。本文概述了迄今已定位及克隆的稻瘟病抗性基因，以及最近利用DNA分子標記加速抗瘟水稻品種選育的進展，并對當前抗性基因定位與克隆和它們在分子育種上應用所面臨的問題進行探討。

1 稻瘟病抗性基因定位與克隆

水稻中很多抗稻瘟病基因已經被定位和深入研究，目前，已經定位了86了抗稻瘟病基因，其中有25個基因被成功克隆。見表1。

表1 水稻中已克隆的抗稻瘟病基因以及與它們緊密連鎖的標記

2 利用抗稻瘟病基因育種

過去30年，國際水稻研究所利用傳統育種方法給優良品種導入了大量的抗病基因[6]。但是，傳統育種方法有以下不足：育種周期長，導入的抗性基因少，育成的品種容易喪失抗性。加之抗稻瘟病育種還面臨的兩個常見問題是：第一，我們目前還不完全清楚持久抗性的遺傳機理；第二，選擇具有多個抗性基因的個體可能干擾育種進程，原因是，基因之間具有上位性。分子標記技術為解決這兩個問題提供了可能，分子標記可以提高遺傳分析的效率和加速得出結論，特別適用于多個抗病基因存在于一個品種中時[7]；與抗病基因連鎖的分子標記作為選擇工具加速選擇抗病基因組合符合要求的品系[8]，利用這個工具我們可以利用用傳統的方法培育持久抗病的品種。水稻分子遺傳圖譜問世加速了分子標記輔助選擇技術（MAS）在育種上的應用[9,10]。

由主效抗病基因控制完全抗性基因已在育種中廣泛應用，已有pi5、Pita、Piz和Pi2等通過MAS方法導入新的水稻品種[11-14]。但是，由于稻瘟病菌具有高度變異性和不穩定性，使得具有單一抗病基因的抗性品種經過2-3年推廣種植后就成為感病品種[15]。對于此可應用聚合育種解決，如Hittamani等將稻瘟病抗性基因Pi5、Pi1和Pi1聚合到同一品系BLl24中[5]；陳紅旗等利用分子標記技術聚合Pi1、Pi2和Pi1基因改良金23B的稻瘟病抗性[16]，以上的研究表明.分子標記輔助育種技術已成為多基因聚合的有效手段。

3 問題與展望

對于稻瘟病的研究，此前，抗性基因的定位和克隆是利用正向遺傳學經典方法—QTL定位和圖位克隆方法，但由于受研究材料遺傳背景和分子標記密度制約，近年來定位新抗性基因和克隆已定位抗性基因越來越難，水稻基因組測序的完成，使得利用反向遺傳學方法定位和克隆更多抗性基因成為可能，魏興華等通過全基因組關聯分析技術（Genome-wide Association Study, GWAS）分析了一個秈稻群體的稻瘟病抗性，檢測到已克隆抗稻瘟病基因Pia，定位到Pif位點的候選基因，幷在第3染色體定位了新抗性基因[17]，一些研究人員提出GWAS定位方法存在假陽性，但通過參數優化和重復實驗可以降低假陽性率[18]，因此，對于GWAS定位和克隆抗稻瘟病基因還需進一步研究。

抗性基因生產應用方面，廣譜抗性基因往往比單一抗性的基因更具優勢，由QTLs控制的部分抗性不具有小種專化性，抗性更持久[19]。隱性基因Pi21和抗穗瘟顯性基因Pbl均為高水平的部分抗性基因，攜帶Pi21的抗源品種Owarihatamochi在日本應用80多年來一直保持高水平的部分抗性，攜帶Pbl的部分抗性品種也已在日本連續推廣應用15年以上仍未喪失抗性。在育種上，Pi21可通過RNAi抑制顯性基因的表達加以利用，Pbl基因則可通過分子標記輔助選擇（MAS）或轉基因手段直接利用。對于稻瘟病抗病育種，利用分子標記輔助選擇育種已成為趨勢，但面臨如下問題：第一，技術成本高；第二，用于選擇的分子標記決定表型的可靠性低。對于第一個問題，我們既要考慮成本，又要考慮產出，也就是加速育成品種，給育種帶來了更高的收益。

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