‘神農菊’揮發油提取優化及其在牛奶中的抑菌性能*

宋彥麗，蔣細旺，王金新，張建

(江漢大學 生命科學院，湖北武漢，430056)

‘神農香菊’(Dendranthema indicum(L.)Des Moul.var.aromaticum Q.H.Liu et S.F.Zhang)原產于湖北神農架，為武漢植物研究所劉啟宏先生于1982年發現并命名的一種新資源植物，全株具有濃郁的香氣［1］。研究發現，‘神農香菊’中含有豐富的揮發油［2］，揮發油存在于植物的油室、油管、分泌細胞或樹脂道中，由萜烯類化合物、醛酯類及醇類化合物等化學成分組成。國內外研究表明揮發油具有抗菌消炎、抗氧化、抗腫瘤、抗病毒等多種藥理功能［3-6］，這引起了現代化食品、煙草、醫藥等行業的廣泛關注［7～9］。

在植物性天然香料生產方法中，用于提取揮發油的方法主要有水蒸氣蒸餾法［10］、超臨界流體萃取法［11］、有機溶劑萃取法［12］等，從提取成本、產量、操作、環保、安全等多方面綜合考慮，選用成本低、操作簡單、環保、產品安全系數高的水蒸氣蒸餾法來提取菊花揮發油在相關行業最具普遍性。

為了進一步開發‘神農香菊’，項目組在引種栽培、建立其體細胞胚胎發生體系的基礎上［13-15］，利用細胞工程技術以產于湖北省神農架地區的‘神農香菊’為材料獲得了相應的耐熱體細胞無性系變異體［16-18］，經過9 a的篩選、種植，獲得了性狀穩定的茶用菊花新種質(待發表)，暫命名為‘神農菊’。迄今為止，對‘神農菊’揮發油的提取工藝與其在牛奶中的應用尚未見報道。本研究以‘神農菊’揮發油提取率為評價指標，在蒸餾提取時間、提取料液比、提取氯化鈉濃度的單因素試驗基礎上，根據Box-Benhnken中心組合試驗設計原理，運用響應面分析法(Response Surface Methodology，RSM)［19-20］對‘神農菊’揮發油的提取條件進行了分析和優化，根據試驗數據建立了二次多項式回歸方程，得到了提取‘神農菊’揮發油的最佳工藝條件，在其工業化生產中具有深遠意義。同時，為了進一步開發應用‘神農菊’揮發油，對最優化條件下提取的揮發油進行了體外抑菌試驗。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料:‘神農菊’，采自江漢大學生命科學學院實驗基地，處理后材料的含水率低于8%，用高速中藥粉碎機粉碎過60目篩，保存于4℃冰箱備用。鮮牛乳，市售已經過消毒滅菌的光明鮮牛乳(距生產日期2 d)。

NaCl、吐溫-80(乳化劑)等化學試劑均為分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 ‘神農菊’揮發油的提取方法

取粉碎度為60目的‘神農菊’試樣50 g，配制一定濃度的NaCl溶液，在燒杯中與‘神農菊’充分混勻，置2 000 mL圓底燒瓶中，加數粒玻璃珠并振搖混合。參照中國藥典一部附錄XD并做一定的改動，連接揮發油測定器與回流冷凝管，自冷凝管上端加氯化鈉溶液使其充滿揮發油測定器的刻度部分，然后將燒瓶置電熱套中加熱至微沸，調壓并保持微沸狀態，自冷凝管滴下第1滴水開始計時，蒸餾一定時間，收集揮發油并精密稱重，計算提取率:

1.2.2 ‘神農菊’提取物揮發油在牛奶中的抑菌效果

取750 mL的鮮牛乳均分為15份，分成3組，每組處理分別為空白對照、陰性對照、揮發油(最優條件下提取)，10%吐溫-80溶液稀釋揮發油至適宜濃度(過濾除菌)，添加適量于鮮牛乳中使其濃度分別為0.05%、0.1%、0.2%作為試驗組，25℃水浴敞口放置。采用平板菌落計數法(參照GB4789.2-2010《食品微生物學檢驗菌落總數測定》)，分別按照一定的稀釋梯度稀釋，并涂于固體培養基上于37℃恒溫培養箱培養48 h。為減少偶然誤差，分別在試樣處理時與24 h水浴后在超凈工作臺上各測定一次，計算菌落總數:

1.3 數據處理

相同提取條件與相同處理條件下，對樣品均進行3次平行試驗，試驗結果取其平均值。

2 結果與分析

2.1 揮發油的提取優化

2.1.1 單因素試驗

分別就浸泡時間、蒸餾時間、料液比、NaCl濃度等實驗因素對‘神農菊’揮發油得率的影響進行了預試驗。結果顯示，浸泡時間對揮發油得率的影響不顯著，而蒸餾時間、料液比、NaCl濃度對揮發油的得率影響較大。為進一步了解蒸餾時間、料液比、NaCl濃度3種因素對揮發油提取率的影響特性，項目組通過單因素試驗對3種因素進行了研究。

2.1.1.1 蒸餾時間對‘神農菊’揮發油提取率的影響

按照1.2.1節的方法，設6組試驗，溶劑為5%氯化鈉溶液，料液比為1∶10，而蒸餾時間分別設置為2、3、4、5、6、7 h，進行水蒸氣蒸餾，稱重并計算提取率，結果見圖1。

從圖1可以看出，隨著蒸餾時間的增加，揮發油提取率不斷提高，蒸餾時間為5 h時得率最高，當提取時間達到6 h時，揮發油的得率反而有緩慢下降的趨勢。

圖1 提取時間對揮發油得率的影響Fig.1 Effect of extraction time on the extraction rate of the volatile oil from the C.morifolium cv Shennongju

根據鹽析法原理及傳熱傳質原理［21-22］，隨著提取時間的增加，無機鹽離子在與揮發性成分爭奪水分子過程中逐漸占據主導地位，這使得從溶液中分離出來的揮發性物質越來越多，并在提取時間5 h時提取率達到最大;但隨著時間的增加，無機鹽離子與水分子結合的過程達到動態平衡，且由于高溫環境破壞了部分沸點較高的揮發性成分，從而導致提取率下降。

綜合考慮提取效率和提取質量，選擇提取時間為4～6 h作為進一步研究的有效水平區間。

2.1.1.2 料液比對‘神農菊’揮發油提取率的影響

按照1.2.1節的方法，設6組試驗，溶劑為5%NaCl溶液，蒸餾時間3 h，料液比分別設置為1∶8、1∶10、1∶12、1∶14、1∶16、1∶18(g∶mL)，進行水蒸氣蒸餾，稱重并計算提取率，結果見圖2。

圖2 料液比對揮發油的率的影響Fig.2 Effect of fliquid to material ratio on the extraction rate of the volatile oil from the C.morifolium cv Shennongju

由圖2可得隨著料液比的加大，揮發油得率不斷提高，當料液比為1∶14時達到最高，隨著料液比的繼續加大，揮發油的得率緩慢減少。

由于無機鹽離子在提取體系中爭奪水分子能力有限，隨著料液比的增加，有效的揮發性分子量增加，在8～14倍溶劑倍量內，揮發油的提取率持續增加;但在14～18倍溶劑倍量范圍內，由于其他成分的析出阻礙了揮發性成分的有效析出，故繼續增大溶劑倍量，反而降低了揮發油的提取率。

綜合考慮提取的效率及揮發油的純度，選擇料液比為1∶12～1∶16作為進一步研究的有效水平區間。

2.1.1.3 NaCl濃度對‘神農菊’揮發油提取率的影響

按照1.2.1節的方法，設6組試驗，料液比為1∶10，蒸餾時間為3 h，NaCl濃度分別設置為0%、5%、10%、15%、20%、25%進行水蒸氣蒸餾，稱重并計算提取率，結果見圖3。

圖3 NaCl濃度對揮發油得率的影響Fig.3 Effect of concentration of sodium choride on the extraction rate of the volatile oil from the C.morifolium cv Shennongju

由圖3可以看出隨著NaCl濃度的不斷加大，揮發油的得率不斷提高，當NaCl濃度為15%是時，揮發油的得率達到了最高，隨著NaCl的濃度繼續加大，揮發油得率反而減少。

隨著NaCl濃度的增加，試驗體系中無機鹽離子爭奪水分子的能力不斷增加，導致揮發性物質的溶解度不斷降低，故NaCl濃度在0% ～15%濃度內，揮發油的得率不斷增加;但無機鹽濃度大于15%，隨著NaCl濃度的增加，由于樣品中其他難溶性成分析出阻礙了揮發性成分的分離，從而出現了持續增加無機鹽濃度，揮發油得率反而降低的現象。

綜合考慮提取的效率及揮發油的純度，選擇揮發油提取NaCl濃度為10% ～20%。

2.1.2 采用響應面分析法對‘神農菊’揮發油提取工藝的優化

2.1.2.1 響應面分析因素水平的選取

依據Box-Benhnken的中心組合試驗設計原理，綜合2.1.1節單因素影響試驗結果，選取提取時間、溶劑倍量(即液料比)、NaCl濃度對‘神農菊’揮發油得率影響顯著的3個因素，在單因素試驗的基礎上采用3因素3水平的響應面分析方法做了進一步的實驗研究。試驗因素與水平設計見表1。

表1 響應面實驗因素與水平Table 1 Code values and actual values of the optimzation variables used in Box-Benhnken experimental design

2.1.2.2 響應面分析試驗設計方案

以提取時間A、溶劑倍量B、氯化鈉濃度C為自變量，以變異菊花揮發油得率Y為響應值，進行響應面分析實驗。實驗方案及實驗結果見表2。

表2 ‘神農菊’揮發油萃取響應面實驗設計及結果Table 2 Box-Benhnken experimental design and corresponding result of the extraction rate of the volatile oil from the C.morifolium cv Shennongju

2.1.2.3 多元二次響應面回歸模型的建立與分析

用RAM軟件對表2試驗結果進行二次回歸響應面分析，建立多元二次響應面回歸模型:

式(3)中:Y為‘神農菊’揮發油提取率的預測值;A、B、C分別為蒸餾時間、溶劑倍量與NaCl濃度的編碼值。

各因素的方差分析見表3。

表3 響應面方差分析Table 3 ANOVA of response surface parameters

從表3的方差分析可見，回歸方程各因子與響應值之間的線性關系具有顯著性。蒸餾時間A、NaCl濃度C、蒸餾時間與溶劑倍量的交互作用AB、溶劑倍量與NaCl濃度之間的交互作用BC均對‘神農菊’揮發油的提取率有顯著性影響，其 Prob值分別為0.037 5、0.015 2、0.041 7、0.043 7。

溶劑倍量B、蒸餾時間與NaCl濃度的交互作用AC對‘神農菊’揮發油的提取率無顯著性影響，Prob值分別為0.764 4、0.549 5。同時可以看出影響‘神農菊’揮發油提取率的各因素大小為C＞A＞B。由響應面軟件SAS8.0.6得到的分析結果可知:模型的R=93.3%，證明這種實驗方法是可靠的，使用該方程模擬真實的3因子3水平的分析是可行的。

從表3可以看出，蒸餾時間與溶劑倍量的交互作用、溶劑倍量與NaCl濃度之間的交互作用顯著，實驗結果見圖4和圖6，蒸餾時間與NaCl濃度的交互作用見圖5。

2.1.2.4 模型的驗證性試驗

通過解‘神農菊’揮發油得率的二次多項數學模型，得出最佳提取條件為:提取時間為5.18 h、溶劑倍量為14.15倍、NaCl濃度16.58%。在最佳化提取條件下，‘神農菊’揮發油提取率的預測值為0.566%。

為檢驗RSM法的可靠性，根據上述最優提取條件，對‘神農菊’揮發油進行了提取。同時為方便實際操作，節約生產成本，將‘神農菊’揮發油的提取最佳條件修正為提取時間為5 h、溶劑倍量為15倍、氯化鈉濃度為16.5%，并在此條件下進行3次平行試驗，實際測得的提取率均值為0.559%，與理論預測值比較接近，說明采用RSM法優化得到揮發油的提取工藝條件準確可靠，具有實用價值。

圖4 蒸餾提取時間與溶劑倍量交互作用對變異菊花揮發油提取率影響的響應面圖Fig.4 Response surface plots for the interactive effects of extraction time and fliquid to material ratio on the extraction rate of the volatile oil from the C.morifolium cv Shennongju

圖5 蒸餾提取時間與NaCl濃度交互作用對變異菊花揮發油提取率影響的響應面圖Fig.5 Response surface plots for the interactive effects of extraction time and concentration of sodium choride on the extraction rate of the volatile oil from the C.morifolium cv Shennongju

圖6 NaCl濃度與溶劑倍量交互作用對變異菊花揮發油提取率影響的響應面圖Fig.6 Response surface plots for the interactive effects of concentration of sodium choride and liquid to material ratio on the extraction rate of the volatile oil from the C.morifolium cv Shennongju

2.2 ‘神農菊’揮發油對牛乳中微生物的抑制作用

通過平板菌落計數法，測出每板菌落數，利用公式(2)計算出鮮牛乳在處理時與24 h敞口放置后總菌數。詳情見圖7和圖8。

圖7 處理時牛乳中微生物的總菌數Fig.7 The total count of microorganisms in milk processing

圖8 24 h后牛乳中微生物的總菌數Fig.8 The total count of microorganisms in milk after 24h

由圖7可以看出，處理時各個試樣的微生物數量相差不顯著;圖8試驗結果顯示，25℃恒溫水浴24 h后微生物的數量達到107CFU/mL，空白對照與陰性對照牛乳中總菌數沒有明顯差異，加入‘神農菊’提取物揮發油后較未加揮發油的牛乳中的總菌數明顯減少，且與揮發油濃度呈正相關。

試驗結果表明，在溫度高于25℃的夏天，鮮牛乳開蓋24 h后微生物數量已嚴重超標，不再適宜飲用;‘神農菊’揮發油對微生物有明顯的抑制作用，但抑制作用有限。有相關研究報道植物揮發油具有一定的抗菌活性［23-24］，但對不同菌種的抑制程度差異較大，且抑菌成分及抑制機理等問題尚不明確，需要進一步研究。

3 結論

RSM法是一種優化反應條件和加工工藝參數的方法，具有周期短、試驗次數少、求得的回歸方程精度高等優點。通過RSM法得到提取‘神農菊’揮發油的最佳條件:提取時間5.18 h、溶劑倍量為14.15倍、NaCl濃度16.58%;兼顧操作性及生產成本，選取提取時間5 h、溶劑倍量為15倍、NaCl濃度16.5%的提取條件，得到實際提取率為0.559%，與理論預測值0.566%相差僅為0.11%;在試驗過程中選擇NaCl溶液代替蒸餾水來提取揮發油明顯改善了揮發油貼壁與下沉的現象，這一結論對‘神農菊’進一步的開發、加工提供較好的理論基礎和實踐指導。

體外抑菌實驗結果顯示‘神農菊’揮發油具有一定的抑菌作用，并與揮發油的濃度成正相關。添加適量的揮發油除能延長牛乳保質期外又增添了揮發油的保健功能。這一研究結論為揮發油作為天然防腐劑來替代食品防腐劑提供了一定的理論參考，具有較高的應用價值。

［1］ 劉啟宏，張紅旗，賈衛疆.湖北新資源植物——神農香菊的地理分布、生態習性與蘊藏量的調查研究［J］.武漢植物學研究，1983，1(2):239-246.

［2］ 姜從良，蘆金清，李竣，等.神農香菊中揮發油、總黃酮與杭菊花、貢菊花的比較研究［J］.湖北中醫學院學報，2001，3(3):48-49.

［3］ Ukiya M，Akihisa T，Yasukawaet K，et al.Constituents of compositae plants.2.Triterpene diols，triols，and their 3-ofatty acid esters from edible chrysanthemum flower extract and their anti-inflammatory effects［J］.J Agric Food Chem，2001，49(7):3 187-3 197.

［4］ P.Alvarez Castellanos P，D Bishop C，Jpascual Villalobos M.Antifungal activity of the essential oil of flowerheads of garland chrysanthemum(Chrysanthemum coronarium)against agricultural pathogens［J］.Phytochem，2001，57(1):99-102.

［5］ Lee J S，Kim H J，Lee Y S.A new anti-HIV Flavonoid Glucuronide from Chrysanthemum morifolium［J］.Planta Med，2003，69(9):859-861.

［6］ SU J，TAN L，LAI P，et al.Experimental study on anti-inflammatory activity of a TCM recipe consisting of the supercritical fluid CO2extract of Chrysanthemum indicum，patchouli oil and zedoary turmeric oil in vivo［J］.J Ethnopharmacol，2012，141(2):608-614.

［7］ 房海靈，郭巧生，申海進.在5種食用油中野菊花揮發油的抗氧化能力研究［J］.植物資源與環境學報，2010，19(2):54-59.

［8］ 謝超.神農香菊抗氧化活性及其應用研究［D］.武漢:湖北中醫藥大學，2012:57-74.

［9］ 田碩，苗明三.菊花的研究及應用現狀［J］.中醫學，2014，29(190):378-380.

［10］ Mustafa Z.Ozel﹒ HilalKaymaz.Superheated water extraction，steam distillation and Soxhlet extraction of essential oils of Origanumonites［J］.Anal Bioanal Chem，2004，379(7/8):1 127-1 133.

［11］ JU Hen-yi，HUANG Kuo-chuan，Chen Jiann-Hwa，et al.Optimization of the extraction of Alpiniaoxyphylla essence oil in supercritical carbon dioxide［J］.J Am Oil ChemSoc，2010，87:1 063-1 070.

［12］ 蔣紅梅，盧向陽，方俊，等.石香薷揮發油提取工藝研究［J］.中藥材，2007，9(30):1 135-1 139.

［13］ 蔣細旺，張啟翔.地被菊間接體細胞胚發生途徑的轉基因受體體系的研究［J］.林業科學研究，2007，20(3):328-333.

［14］ 蔣細旺，陳發菊，陸苗，等.地被菊直接體細胞胚發生研究［J］.北京林業大學學報，2008，30(2):65-70.

［15］ JIANG X W，ZHANG Q X，ZHANG P，et al.Heat tolerance of ground-cover Chrysanthemum［J］.Acta Horticulturae，2008，766:89-96.

［16］ JIANG X W，YANG X.High semi-lethal temperature and heat tolerance of tea Chrysanthemum［J］.Acta Horticulturae，2013，977:369-376.

［17］ 楊小秋，韓磊，傅厚暾，蔣細旺.高效液相色譜紫外檢測法測定茶(藥)用菊花的綠原酸含量［J］.分析儀器，2013(1):12-15.

［18］ 蔣細旺.花草茶的種類、保健功能及使用［J］.長江大學學報:自然科學版，2013，10(17):62-66.

［19］ Macros A B，Ricardo E.S，Eliane P O，et al.Response surface methodology(RSM)as a tool for optimization in analytical chemistry［J］.Talanta，2008，76(5):965-977.

［20］ LI Quan-hong，FU Cai-li.Application of response surface methodology forextraction optimization ofgerminant pumpkin seeds protein［J］.Food Chem，2005，92(4):701-706.

［21］ 楊義芳.中藥與天然活性產物分離純化和制備［M］.北京:科學出版社，2011.

［22］ Frank P Incropera.Fundamentals of heat and mass Transfer［M］.The United States of America:John Wiley ＆Sons Inc，2006.

［23］ Ahlem Ben Sassi，Fethia Harzallah-Skhiri，Imed Chraief，et al.Chemical composition and antimicrobial activities of the essential oil of(Tunisian)Chrysanthemum trifurcatum(Desf.)Batt.and Trab.flowerheads［J］.Science-Direct，2008，11:324-330.

［24］ Bajpai Vivek K，Sharma Ajay，Baek Kwang-Hyun.Antibacterial mode of action of Cudrania tricuspidata fruit essential oil，affecting membrane permeability and surface characteristics of food-borne pathogens［J］.Food Control，2013，32(2):582-590.