泡菜微生物群落結構及其動態機制研究概述*

鄒偉，趙長青，趙興秀，張靜

(四川理工學院生物工程學院，四川自貢，643000)

泡菜主要以新鮮蔬菜為原料，添加或不添加輔料，在3% ～7%的食鹽水中，經微生物自然發酵15～30 d，腌漬成菜［1］。泡菜是我國傳統發酵食品，早在距今3千多年前的商朝就已經是人們飲食文化的一部分［2］，其味道酸鮮純正，脆嫩芳香，清爽可口，同時還富含多種纖維素、氨基酸和微量元素，能促進腸胃消化，提高人體免疫能力。近20年，我國泡菜產業發展迅速，2013年中國泡菜的產值已突破150億元，年均增長速度為20% ～30%。目前，泡菜的生產采用高鹽、浸泡等傳統生產工藝，生產環境差，規模偏小，工序復雜，勞動強度大，受季節影響等限制，產品質量極不穩定，其國際知名度與韓國泡菜(kimchi)、日本泡菜相比較低。造成這些現象的實質是泡菜的生產過程是依靠自然微生物發酵進行，微生物群落在泡菜腌制過程中產生各種酶，以及自身生長過程中產生的中間代謝產物等，為泡菜特殊風味物質的產生提供物質基礎。這一過程耗時較長且容易受到自然環境中區域、溫度、濕度等因素的影響，因而不同批次產品的質量會出現較大的差異，從而導致產品質量參差不齊。目前泡菜的生產工藝急需進行標準化升級，強化生產工藝，穩定產品的質量。解決目前現狀的關鍵是弄清我國泡菜發酵過程對其特殊風味物質形成相關的微生物群落組成及其發酵機制。本文主要綜述了近幾年針對泡菜微生物群落發酵機制的研究進展。

1 泡菜中微生物群落結構

泡菜的發酵是一個開放式、厭氧的環境，初始微生物是鹽水浸沒時殘留于蔬菜上的微生物，隨著發酵的進行，微生物群落的種類和數量不斷演替，最終使泡菜形成特有的風味［3］。這其中對風味起主要作用的是乳酸菌、酵母菌，同時還存在一些其他的微生物。

早期主要通過傳統的分離純化和形態生理特征鑒定來研究泡菜中的乳酸菌系。例如鐘之絢等在泡白菜的發酵前檢測植物乳桿菌，中期有植物乳桿菌、格氏乳桿菌、彎曲乳桿菌、德氏乳桿菌德氏亞種和乳糖亞種，后期有植物乳桿菌和棉子糖鏈球菌，共5種和2個亞種［4］。最近，Xiong Tao等發現泡菜發酵過程中優勢乳酸菌有 Enterococcus faecalis、Lactococcus lactis subsp.Lactis、Leuconostoc mesenteroides subsp.Mesenteroides、Lactobacillus plantarum、Lactobacillus casei和Lactobacillus zeae［5］。細菌形態生理特征鑒定適用于屬的鑒別，而對種的確定不太明顯［6］。基于菌種16S rRNA序列結合傳統形態生理特征方法可以更精確鑒定分離的菌種。盛海圓等利用此法鑒定了從傳統泡菜中篩得的46株菌，分布于乳桿菌屬、腸球菌屬、葡萄球菌屬和片球菌屬4個屬的9個種，并發現存在 Lactobacillus namurensis和巴氏葡萄球菌［7］。上述方法局限于對可培養微生物的鑒定，但目前實驗室能夠培養分離出的微生物占環境樣品的比例不到1%［8］，因此需要一系列“免培”的檢測方法(如聚合酶鏈式反應和變性梯度凝膠電泳相結合(PCRDGGE)、16S rRNA基因文庫等)用于研究泡菜發酵過程乳酸菌群落的組成、豐度及其變化情況。代道芳同時用生理形態鑒定和PCR–DGGE鑒定了泡菜中的乳酸菌系［9］，發現經表型特征和系統的生理生化實驗鑒定，泡菜中的乳酸菌為乳桿菌屬、鏈球菌屬、四聯球菌屬3個屬，植物乳桿菌、德氏乳桿菌、干酪乳桿菌、乳酸鏈球菌、鹽水四聯球菌5個種。經DGGE鑒定出泡菜中含有的保加利亞乳桿菌、乳酸鏈球菌、漫游球菌、植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌有較近的親緣關系，相似性達到100%。類似的關于泡菜乳酸菌群落的研究詳見表1。

表1 國內泡菜發酵微生物群落的相關研究Table 1 Research on the microbial community of Chinese sauerkraut fermentation

上述研究主要針對泡菜中乳酸菌的構成，對乳酸菌在泡菜發酵過程中的動態演變卻研究較少(表1)。通常在泡菜發酵啟動時主要是酸耐受性低、微厭氧的乳酸菌如Leuconostoc屬的 Leu.mesenteroides、Leu.Citreum，隨著發酵的進行乳酸積累，嚴格厭氧環境的形成、酸耐受性高、嚴格厭氧的乳酸菌如Lactobacillus、Weissella屬的 L.sakei、L.plantarum、W.koreensis漸占主導［18］。XIONG Tao等通過傳統方法證實泡菜發酵啟動過程L.mesenteroides subsp.Mesenteroides占主導，然后逐步由 E.faecalis、L.lactis、L.zeae 替代，最終由L.plantarum和L.casei完成發酵［5］。目前，基于“免培”的方法探究中國泡菜中乳酸菌群落動態變化的研究尚無，這也是未來研究的一個熱點方向。

除乳酸菌外，酵母菌在泡菜發酵中也起著重要作用。酵母菌能消耗可發酵糖，主要生成乙醇、少量甘油和一些特殊風味的醇類物質，可抑制有害菌如腐敗菌的生長，有利于泡菜后熟階段發生醋化反應和芳香物質的形成。張先琴等通過PCR-DGGE發現四川地區家庭制作泡菜中真菌主要有熱帶假絲酵母、漢遜德巴利酵母、奧默柯達菌和一些不可培養的真菌等［12］。曾俊等從自制四川泡菜中分離鑒定2種酵母:單孢釀酒酵母、膜璞畢赤酵母，它們均存在于泡菜發酵前期，隨著發酵進行數量持續減少，5 d后消失［16］。此外，酵母菌 P.manshurica、P.kudriavzevii、C.tropicalis等經鑒定大量繁殖會使腌漬品的表面生花，產生不愉快的酸臭味，最終導致產品變質［19］，必須引起重視。

在泡菜發酵過程中，除乳酸菌、酵母之外還存在其他微生物。張宗舟等發現泡菜中微生物菌系還包括醋酸菌和丁酸菌［15］。Yang Hongyan等通過基因文庫鑒定發現泡菜中存在 Acinetobacter sp.、Pseudomonas fragi、Klebsiella sp.、Citrobacter sp.、Betaproteobacteria sp.等細菌［17］。田偉等發現泡菜中不可培養細菌占總細菌數的32%，但不可培養微生物在泡菜中的作用還有待闡明［13］。另外，Lu等人證實泡菜中存在噬菌體可侵染乳酸菌［20］。最近，研究人員在韓國泡菜中發現噬菌體基因［21］，相關研究在國內尚未見報道。

2 外界因素對泡菜微生物群落的影響

泡菜發酵是一個多種微生物共存的混合發酵體系，不同的發酵蔬菜品種，氣候、地域、過程加工的參數均能夠影響泡菜發酵過程的微生物群落，最終導致風味、口感、營養的不同。通過操縱這些因素，使微生物群落朝著有利的方向演替，是改造泡菜生產工藝的關鍵。泡菜中起主要作用的是乳酸菌系［22］，因此需要調控發酵條件，促進乳酸菌的生長繁殖，并抑制有害微生物的生長。乳酸菌最適宜的溫度范圍是26～30℃［23］，在該溫度段，乳酸菌生長繁殖最快，產酸率最高。發酵初始時為抑制兼性厭氧細菌和酵母的生長，溫度不宜過高，待乳酸積累一定量后，可適當提高溫度，發酵結束后應將溫度降低，防止產酸過高。楊瑞等發現在發酵溫度為26℃時，泡菜中微生物的生長速度遠比18℃時快，但乳酸菌此時不能形成生長優勢［24］。

泡菜生產過程需要加入一定量的食鹽，泡菜微生物群落成員對食鹽濃度的耐受性各不相同。通常乳酸菌能夠耐受8%的食鹽濃度［25］，發酵泡菜常用的食鹽濃度在3% ～6%［23，25］，濃度過低時乳酸菌雖然生長迅速，但對有害微生物的抑制不明顯，食鹽濃度應控制在既能抑制有害微生物又不影響乳酸菌發酵活動的范圍之內。尹立端等發現10%的食鹽能延長異型乳酸菌的發酵時間，較顯著抑制真菌和腸道菌的生長，4%的食鹽能縮短異型乳酸菌的發酵時間，較大程度抑制腸道菌和芽孢菌的生長，7%的食鹽腌制的泡菜產品感官評定優于前2種［26］。研究表明在較低溫度下發酵，6%的鹽濃度比8%的鹽濃度能更好地促進乳酸菌的生長［24］。

pH是影響微生物生長的重要因子，在泡菜發酵過程中，隨著乳酸菌的繁殖，大量分泌乳酸，造成溶液中pH值的下降。但在腌制初期，需要控制發酵的初始pH，抑制其他的雜菌生長，乳酸菌一般能夠耐受的環境 pH 為1.5 ～.5［14，27］，若酸度低于此范圍，便不能生長。黃琴發現添加0.5%乳酸能有效地縮短發酵時間，抑制一部分腐敗微生物的生長，產品的色香味最好［28］。

發酵過程中乳酸菌是厭氧菌，而部分有害菌是好氧菌，隔絕空氣就可抑制這部分有害菌的活動。真空度越高越有利于對泡菜中乳酸菌的增殖，對泡菜中的其他雜菌的抑制作用越明顯［29］。另外，泡菜生產中加入不同比例的天然物質，可以增進泡菜的風味。添加花椒、大蒜、茴香、辣椒能明顯促進乳酸菌生長［24，30］，添加花椒同時還能促進酵母的生長［24］。孫力軍等進一步證實大蒜、茴香、辣椒3種香辛料主要對明串珠菌和植物乳桿菌有促進作用［30］。

在發酵初始添加乳酸菌活菌制劑，促使乳酸菌在發酵初始便處于優勢地位，縮短發酵周期，也是常用的調控泡菜發酵微生物群落結構的手段。與自然發酵相比，直投乳酸菌劑發酵具有縮短發酵周期，降低發酵鹽用量，提高益生菌含量等優點［31］。目前泡菜直投式菌劑有單獨用植物乳桿菌［32］、嗜酸乳桿菌［33］或者混合使用多種乳酸菌如:腸膜明串珠菌和植物乳桿菌［34］、戊糖片球菌和植物乳桿菌［35］、短乳桿菌和植物乳桿菌［36］。熊濤等發現相比于自然發酵，直投式發酵菌劑對泡菜微生物群落中病原菌(大腸菌群、沙門氏菌與金黃色葡萄球菌)的生長具有顯著抑制作用［32］。

3 宏基因組學技術在泡菜微生物群落中的應用

近年來，隨著高通量測序技術的發展，宏基因組學(也稱元基因組學，metagenomics)在分析發酵過程微生物群落變化等方面展現出巨大的優勢［37］。在元基因組學研究中，借助于大規模序列分析，在基因序列分析的基礎上，結合生物信息學分析工具和相關數據庫，能夠發現大量過去無法得到的未知微生物新基因或新的基因簇，這對了解微生物區系組成、進化歷程和代謝特點，挖掘具有應用潛力的新基因等都具有重要意義［38］。目前，宏基因組分析已用于發酵食品中的微生物群落研究方面，Jung等利用454GS FLX Titanium對Kimchi發酵過程中微生物群落宏基因組學測序，通過宏基因組序列分析研究了Kimchi發酵過程中菌群結構、代謝潛力、群落遺傳特征的變化［21］。但是宏基因組學分析通常僅集中于物種或基因層面，且這些信息是分散的、相互聯系較少的，難以得出明確的、全面的結論。而實際的微生物群落中各個成分是相互作用的，形成一個交錯的網絡。整合這些宏基因組分析得到的物種和功能基因集合，構建從宏基因組學數據到微生物群落生理特性的聯系，并能分析和預測相應的生理功能特點［39］，也是后續工作的熱點。隨著宏基因組學技術以及系統生物學技術的發展，構建微生物群落水平的代謝網絡模型顯得至關重要，也成為一種趨勢［39］。目前，該類系統代謝模型已成功用在分析種間共生、競爭、寄生與進化等相互關系［40］。系統生物學技術研究泡菜發酵過程微生物群落機制的基本路線即通過宏基因組測序，認識泡菜發酵過程的關鍵微生物以及關鍵功能基因，在此基礎上構建泡菜發酵過程微生物群落規模的代謝網絡模型，借助于系統生物學分析方法，解析泡菜發酵過程不同階段的代謝特性，關鍵節點等，從而揭示泡菜發酵過程的相關機制。系統生物學技術的應用，將為泡菜的生產工藝現代化、標準化改進提供理論基礎，同時也為其他傳統醬腌菜研究提供參考。

［1］ 李幼筠.中國泡菜的研究［J］.中國調味品，2006(1):57-63.

［2］ 陳功，夏有書，張其圣，等.從中國泡菜看四川泡菜及泡菜壇［J］.中國釀造，2010(8):5-8.

［3］ 李文斌，宋敏麗，唐中偉，等.自然發酵泡菜微生物群落變化的研究［J］.中國食物與營養，2008(11):22-24.

［4］ 鐘之絢，郭劍.酸白菜發酵中乳酸菌群的分析［J］.微生物學報，1995，35(1):74-76.

［5］ XIONG T，GUAN Q，SONG S，et al.Dynamic changes of lactic acid bacteria flora during Chinese sauerkraut fermentation［J］.Food Control，2012，26(1):178-181.

［6］ 楊瑞鵬，趙學慧.幾種酸泡菜中乳酸菌的分離與鑒定［J］.華中農業大學學報，1987，6(4):346-350.

［7］ 盛海圓，郭艷萍，常艷，等.傳統泡菜中乳酸菌多樣性的分析［J］.中國微生態學雜志，2010，22(7):580-582，586.

［8］ Kaeberlein T，Lewis K，Epstein S S.Isolating"uncultivable"microorganisms in pure culture in a simulated natural environment［J］.Science，2002，296(5 570):1 127-1 129.

［9］ 代道芳.基于宏基因組學技術的傳統發酵泡菜中乳酸菌多樣性研究［D］.南寧:廣西大學，2011.

［10］ 付琳琳.應用PCR-DGGE技術分析泡菜中乳酸菌的多樣性［D］.南昌:南昌大學，2005.

［11］ 張良，曾澤生，邢雅閣，等.四川特色泡菜發酵微生物區系狀況調查研究［J］.中國調味品，2012，37(11):43-47.

［12］ 張先琴，張小平，敖曉琳，等.PCR-DGGE分析四川地區家庭制作泡菜中微生物多樣性［J］.食品科學，2013，34(12):129-134.

［13］ 田偉，張琦比，鄧珍珍，等.利用16S rRNA分析傳統四川發酵泡菜中的細菌多樣性［J］.食品科學，2013，34(17):215-218.

［14］ 陳功，張其圣，余文華，等.四川泡菜乳酸菌多樣性及其功能特性［J］.食品與發酵工業，2013，39(3):1-4.

［15］ 張宗舟，王玉潔，石寶珍.泡菜生產的微生物區系分析［J］.中國釀造，2014，33(3):24-27.

［16］ 曾駿，陳安均，蒲彪，等.傳統四川泡菜中酵母菌的動態變化規律［J］.食品科學，2014，35(7):81-85.

［17］ YANG H，ZOU H，QU C，et al.Dominant microorganisms during the spontaneous fermentation of Suan Cai，a Chinese fermented vegetable［J］.Food Science and Technology Research，2014，20(5):915-926.

［18］ CHANG J Y，CHANG H C.Improvements in the quality and shelf life of Kimchi by fermentation with the induced bacteriocin-producing strain，Leuconostoc citreumGJ7 as a starter［J］.Journal of Food Science，2010，75(2):M103-M110.

［19］ 敖曉琳，蔡義民，夏姣，等.引起泡菜“生花”腐敗微生物的分離鑒定［J］.食品科學，2013，34(21):204-208.

［20］ Lu Z，Breidt F，Plengvidhya V，et al.Bacteriophage ecology in commercial sauerkraut fermentations［J］.Applied and Environmental Microbiology，2003，69(6):3 192-3 202.

［21］ Jung J Y，Lee S H，Kim J M，et al.Metagenomic analysis of Kimchi，a traditional Korean fermented food ［J］.Applied and Environmental Microbiology，2011，77(7):2 264-2 274.

［22］ Daeschel M A，Andersson R E，Fleming H P.Microbial ecology of fermenting plant materials［J］.FEMS Microbiology Letters，1987，46(3):357-367.

［23］ 趙文紅，黃小丹，范敏華，等.自然發酵泡菜中乳酸菌的分離及特性研究(一)［J］.廣州食品工業科技，2003，18(1):77-79.

［24］ 楊瑞，張偉，陳煉紅，等.發酵條件對泡菜發酵過程中微生物菌系的影［J］.食品與發酵工業，2006，31(3):90-92.

［25］ 付莎莉，陳安均，蒲彪，等.食鹽濃度對傳統四川泡菜發酵過程中乳酸菌菌相的影響［J］.食品與發酵工業，2013，39(8):102-107.

［26］ 尹利端，韓北忠，黃晶晶，等.蘿卜泡菜發酵過程中食鹽對微生物變化的影響［J］.中國釀造，2005，144(3):19-21.

［27］ 彭燈水，顏正財，湯春梅，等.泡菜優良發酵乳酸菌耐受特性研究［J］.食品與發酵科技，2010，46(4):50-52，55.

［28］ 黃琴.有機酸對發酵蔬菜品質影響的研究［D］.重慶:西南大學，2009.

［29］ 王世寬，冉燃，侯華，等.減壓處理對四川泡菜微生物菌系的影響［J］.中國釀造，2009，202(1):101-102，104.

［30］ 孫力軍，張中，孫德坤，等.4種香辛料對泡菜發酵過程中乳酸菌生長的影響［J］.食品與發酵工業，2004，30(8):22-24，29.

［31］ 唐雪鷺.直投式乳酸菌劑發酵泡菜的研究現狀及展望［J］.中國調味品，2012，37(12):1-4.

［32］ 熊濤，關倩倩，謝明勇.直投式與傳統發酵泡菜工藝中病原菌的變化規律［J］.食品科學，2012，33(13):140-143.

［33］ 方義川，楊虹坤，何謙，等.直投式乳酸菌發酵劑的研制［J］.現代食品科技，2012，28(8):990-994.

［34］ 壽禹亮，劉麗波，李艾黎，等.直投式發酵劑生產四川泡菜的研究［J］.食品工業科技，2012，33(8):236-238.

［35］ 趙爽，孫娟，劉書亮，等.泡菜直投式乳酸菌發酵劑的制備［J］.食品工業科技，2014，35(17):171-175，179.

［36］ 賀稚非，向瑞璽，李洪軍，等.泡菜活性直投式乳酸菌發酵劑的研究［J］.食品科學，2006，27(8):191-197.

［37］ Handelsman J，Rondon M R，Brady S F，et al.Molecular biological access to the chemistry of unknown soil microbes:a new frontier for natural products［J］.Chemistry and Biology，1998，5(10):R245-R249.

［38］ Kunin V，Copeland A，Lapidus A，et al.A bioinformatician's guide to metagenomics［J］.Microbiology and Molecular Biology Reviews，2008，72(4):557-578.

［39］ Zengler K，Palsson B O.A road map for the development of community systems(CoSy)biology［J］.Nature Reviews Microbiology，2012，10(5):366-372.

［40］ Lewis N E，Nagarajan H，Palsson B O.Constraining the metabolic genotype-phenotype relationship using a phylogeny of in silico methods［J］.Nature Reviews Microbiology，2012，10(4):291-305.