玉米內州萎蔫病菌LAMP快速檢測方法的建立

玉米內州萎蔫病菌LAMP快速檢測方法的建立

單長林1，李雪松1，李孝軍1，周 圓1，楊賽軍1，王 健1,張建成2

(1.舟山出入境檢驗檢疫局,浙江舟山 316000；2.嘉興出入境檢驗檢疫局,浙江嘉興 314000)

摘要[目的] 建立玉米內州萎蔫病菌的快速恒溫擴增檢測技術。 [方法]利用GenBank公布的玉米內州萎蔫病菌(Clavibacter michiganensis subsp. nebraskensis，Cmn) 16S-23S序列設計LAMP (loop-mediated isothermal amplification)引物，建立玉米內州萎蔫病菌LAMP檢測體系，并對反應條件進行了優化。[結果]LAMP 在內引物、環化引物和外引物比為6∶4∶1(30 pmol∶20 pmol∶5 pmol)的25 μl體系下64 ℃反應30 min為最佳反應條件，且LAMP引物能從供試的7種菌株中特異性擴增出Cmn 梯度性條帶。以玉米內州萎蔫病菌基因組和菌懸液梯度稀釋液為模板檢測LAMP體系的靈敏度，結果顯示，LAMP檢測體系針對基因組和菌懸液的靈敏度分別達到了50 fg和3.6 CFU，比普通PCR靈敏度高100倍。[結果]LAMP檢測體系簡單、快速、靈敏度高、特異性好，在玉米內州萎蔫病菌檢測方面潛力巨大。

關鍵詞玉米內州萎蔫病菌；LAMP；檢測

中圖分類號S188

基金項目浙江檢驗檢疫局科研項目(ZK201227);浙江省科技廳重大科技專項重點農業項目(2009C12054)；浙江省科技廳公益技術研究農業項目(2013C32002)。

作者簡介單長林(1987-)，男，山東單縣人，農藝師，碩士，從事進出境動植物檢驗檢疫工作。

收稿日期2015-06-05

The Establishment of a Rapid Detection Method ofClavibactermichiganensissubsp.nebraskensisLAMP

SHAN Chang-lin,LI Xue-song，LI Xiao-jun et al (Zhoushan Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Zhoushan, Zhejiang 316000)

Abstract[Objective]The aim was to establish a rapid detection method of Clavibacter michiganensis subsp. nebraskensis LAMP. [Method] The LAMP primers was designed by the rRNA 16S-23S of the genome of Clavibacter michiganensis subsp. nebraskensis, were verified using Clavibacter michiganensis subsp. nebraskensis and other non-target strains. [Result]The data showed that the optimal amplification condition was at 64 ℃ for 30 min with 30 pmol of F3(B3), 20 pmol of LF(LB) and 5 pmol of FIP(BIP). Both the sensitivity and the specificity of the LAMP assay developed in the study were excellent. The detection limit of the LAMP was as low as 50 fg ( for DNA) and 3.6 CFU (for bacteria) per reaction. Compared with conventional PCR method, the LAMP assay developed in this study was more specific and more sensitive. Therefore, the LAMP method could be considered as an effective tool for the rapid screening of Clavibacter michiganensis subsp. nebraskensis. [Conclusion] The study showed that the loop-mediated isothermal amplification(LAMP) could be used as a reliable, rapid and simple method for detection of Clavibacter michiganensis subsp. nebraskensis (Cmn) causing Goss’s Bacterial Wilt and Leaf Blight of Corn.

Key wordsClavibactermichiganensissubsp.nebraskensis; LAMP; Detection

玉米內州萎蔫病(Goss’s Bacterial Wilt and Leaf Blight of Corn)是由執安棒形桿菌內布拉斯加亞種(Clavibactermichiganensissubsp.nebraskensis,Cmn)引起的一種嚴重的細菌性病害，可導致玉米產量損失率高達50%[1]。自1969年首次發現于內布拉斯加州中部[2],該病通過種子傳帶進行遠距離傳播[3]，目前已擴散至美國多州和加拿大部分地區[4-6]，在我國尚未發現。玉米在我國的播種面積和產量均居世界第二位[7]，而且我國大部分玉米種植區適合Cmn的發生與傳播[8]，該病菌一旦傳入，將嚴重威脅我國糧食生產安全，因此預防和控制玉米內州萎蔫病，對確保玉米生產可持續發展具有極為重要的意義。

Cmn為革蘭氏陽性，不產孢，不固酸，嚴格好氧性，隸屬于厚壁菌門(Firmicutes)厚壁菌綱(Firmibacteria)棒型桿菌屬(Clavibacter)。目前針對其檢測方法主要有分離培養法[9-10]、血清學檢測[11-13]和分子生物學檢測[14-18]等方法，分離培養法和血清學檢測方法操作復雜、耗時較長且靈敏度較低不適合快速檢測。分子生物學檢測方法具備快速、準確和靈敏的特點，但其檢測過程需PCR儀等設備支持，無法實現現場操作。2000年，日本學者Notomi等[19]研發出一種核酸等溫擴增方法——環介導等溫擴增技術(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)，其針對靶標序列的6個區域設計4條引物，在恒溫(60～ 65 ℃)條件下，利用Bst DNA 聚合酶的鏈置換作用，按照目標序列將dNTPs連接完成DNA擴增，同時釋放出焦磷酸根離子。焦磷酸根離子與Mg2+結合生成肉眼可視的白色焦磷酸鎂沉淀，使LAMP結果不必借助其他方式即可快速讀取。因此，恒定的擴增條件，可視的結果顯示使LAMP技術非常適合現場的快速檢測。

玉米內州萎蔫病菌rRNA 16S-23S基因間隔序列已被證實具備菌種間差異性，常用于分子生物學鑒定[20-21]。筆者利用LAMP技術，針對rRNA 16S-23S基因間隔序列設計一套引物，建立玉米內州萎蔫病菌的快速恒溫擴增檢測技術。

1 材料與方法

1.1 菌株供試菌株玉米內州萎蔫病菌(Clavibactermichiganensissubsp.nebraskensis，Cmn)、玉米細菌性枯萎病菌(Pantoeastewartiisubsp.Stewartii，Pss)由浙江省檢驗檢疫科學技術研究院張明哲博士提供；燕麥食酸菌(Acidovoraxavenaesubsp.Avenae，Aaa)、西瓜細菌性果斑病菌(Acidovoraxavenaesubsp.citrull，Aac)、黃單胞菌(Xanthomonasoryzae，oryzae，Xoo)由浙江大學李斌博士提供；菜豆萎蔫病菌(Curtobacteriumflaccumfacienspv.flaccumfaciens，Cff)、丁香假單胞桿菌菜豆致病變種(Pseudomonassyringaepv.phaseolicola，Psp)由舟山出入境檢驗檢疫局國家糧油重點實驗室保存。

1.2 試劑和儀器 LAMP法脫氧核糖核酸擴增試劑盒(榮研)，細菌基因組DNA提取試劑盒(TIANGEN)，DL 2000 DNA Ladder Marker (TaKaRa)，瓊脂糖Agarose H(上海生工)，LB瓊脂(杭州微生物試劑有限公司)；金屬浴Thermomixer comfort(eppendorf),凝膠成像儀(BIO-RAD),紫外分光光度計NANODROP 2000(Thermo)。

1.3 引物設計與合成玉米內州萎蔫病菌16S-23S基因間隔序列已被證實在細菌種間有相當大的可變性,常用來比較細菌的親緣性遠近[22]。根據 GenBank 公布的玉米內州萎蔫病菌Cmn 16S-23s序列(Accession number: JN613835.1)，利用LAMP在線引物設計軟件(V3版)，設計玉米細菌性枯萎病菌LAMP引物。引物序列：F3：CGCTCATGGGTGGAACAT，B3：GTTCTCAATATACGGGCGGT；FIP：CATGCCCTCGACACACCAGACTGATGTGTCGGGCTGCTA，BIP：CGCTGTTGGGT-CCTGAGGGAACGAAAGGACGACGGAAAG；LF：ACCCCACA-AGGAGGCGTA，LB：GCACCTTCGGGTGTGTCTG。引物位置見圖1。

1.4菌體培養和DNA模板制備菌體的活化培養用普通LB固體培養基，涂板后放入25 ℃恒溫培養箱中培養24 h，后挑取單菌落接入普通LB培養液，25 ℃培養12 h(OD600≈0.8)。離心收集菌體，利用TIANGEN細菌基因組DNA提取試劑盒提取細菌基因組，紫外分光光度計Nanodrop 2000檢測提取質量和濃度，-20 ℃備用。

1.5 LAMP 擴增體系優化以脫氧核糖核酸擴增試劑盒(LAMP法)說明書推薦體系為參照。設置反應溫度梯度為61、62、63、64、65 ℃；設置內引物、環化引物和外引物比例分別為2∶2∶1(10 pmol∶10 pmol∶5 pmol)，4∶4∶1(20 pmol∶20 pmol∶5 pmol)，6∶4∶1(30 pmol∶20 pmol∶5 pmol)，8∶4∶1(40 pmol∶20 pmol∶5 pmol)；設置反應時間梯度為15、30、45、60 min。擴增產物加SYBR Green I染料以陰性對照進行目測或于2.0%瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.6特異性驗證取玉米內州萎蔫病菌和各參比菌株基因組，分別取2 μl為模板進行LAMP擴增反應和常規PCR擴增反應[18]，驗證LAMP擴增反應特異性。

1.7 靈敏性檢測 取玉米內州萎蔫病菌基因組，用滅菌的雙蒸水10倍梯度稀釋(10-1～10-7)，取2 μl 為模板分別進行LAMP擴增反應并與普通PCR反應體系[18]比較，驗證LAMP擴增法檢測體系對細菌基因組的靈敏性；制備玉米內州萎蔫病菌懸液，進行10倍梯度稀釋(10-1～10-6)，涂板計數法測定其濃度，分別取2 ul稀釋菌液進行LAMP擴增反應和PCR擴增反應，檢測LAMP等溫擴增對菌體檢測的靈敏度。

2結果與分析

2.1 LAMP 擴增反應體系優化

2.1.1內引物、環化引物和外引物濃度優化。由圖2A、a可知，在引物比為2∶2∶1、4∶4∶1、6∶4∶1、8∶4∶1時均能產生清晰的梯度性條帶，從凝膠成像的條帶亮度上可以看出，引物比為6∶4∶1與8∶4∶1時的條帶相比引物比例2∶2∶1和4∶4∶1時產生的條帶更加明亮；引物比為6∶4∶1與引物比為8∶4∶1時凝膠成像的條帶亮度相當。根據使用較少的內引物產生相似的擴增效果，選擇內引物、環化引物和外引物的比6∶4∶1(30 pmol∶20 pmol∶5 pmol)為LAMP擴增反應最佳引物比例。

2.1.2 擴增反應時間的優化。研究表明，環化引物的加入與未加入相比其LAMP反應時間縮短50%以上[23]，設定擴增反應時間梯度為15、30、45、60 min，以篩選玉米內州萎蔫病菌LAMP檢測方法的最佳反應時間。由圖2B、b可知，LAMP在擴增反應進行15 min即開始產生梯度性條帶，當擴增反應進行到30 min即可產生清晰的梯度性條帶，因此選擇30 min作為 LAMP 擴增體系的最佳反應時間。

2.1.3 擴增反應溫度的優化。由圖2C、c可知，LAMP擴增反應在62、63、64 ℃可以產生清晰的梯度性條帶，其中64 ℃時LAMP擴增產生的條帶更明亮；在61 ℃和65 ℃產生的條帶模糊不清。因此選擇64 ℃作為LAMP擴增體系的反應溫度。

2.2 特異性驗證結果 利用TIANGEN細菌基因組提取試劑盒提取玉米內州萎蔫病菌、參比菌株的 DNA， 紫外分光光度計Nanodrop 2000 驗證提取效果，取2 μl為模板分別進行LAMP擴增反應和PCR擴增反應，驗證LAMP優化體系的特異性。由圖3可知，只有以玉米內州萎蔫病菌為模板進行LAMP能產出清晰的梯度性條帶，其他以參比菌株DNA為模板的LAMP擴增均沒有出現梯度性條帶。結果表明，該試驗建立的針對玉米內州萎蔫病菌的LAMP檢測方法特異性強。

2.3 靈敏度檢測結果

2.3.1基因組DNA靈敏度。提取玉米細菌性枯萎病菌基因組DNA，通過NanodropTM超微量分光光度計測量DNA吸光值，計算DNA濃度為50 ng/μl，調整濃度至25 ng/μl， 10倍梯度稀釋，進行LAMP擴增和普通PCR擴增，驗證LAMP優化體系針對基因組的靈敏度。由圖4A、a可知，LAMP檢測體系檢測靈敏度可達2.5×10-5ng/μl，即每反應體系需50 fg(2 μl，2.5×10-5ng/μl)模板，比普通PCR(圖 4B)檢測靈敏度(5 pg)高100倍。

2.3.2 菌體檢測靈敏度。取100 ul玉米內州萎蔫病菌菌懸液原液，用雙蒸水進行10倍梯度稀釋，涂板測定玉米內州萎蔫病菌菌懸液濃度為1.8×109CFU/ml,分別取2 μl稀釋液為模板進行LAMP擴增和普通PCR擴增反應，驗證LAMP優化體系針對菌體的靈敏性。由圖4D、d可知，LAMP檢測體系檢測靈敏度能夠達到3.6 CFU(2 μl,1.8×103CFU/ml)，而普通 PCR的檢測靈敏度為3.6×102CFU(2 μl,3.6×105CFU/ml)(圖4E)。對比LAMP體系和普通PCR體系凝膠成像結果表明，LAMP 檢測體系的靈敏度比普通 PCR 的靈敏度高100倍。

3結論與討論

我國玉米產量和種植面積均居世界第二位，玉米在我國糧食生產中占據重要地位。從2010年起，我國出現玉米凈進口態勢，2012～2014年，3年玉米進口總量超過1 000萬t。玉米內州萎蔫病菌隨進口玉米傳入我國的風險很高。目前針對玉米內州萎蔫病菌的檢疫方法主要有分離培養法、酶聯免疫法、常規PCR、TagMan-PCR、巢氏PCR、REP-PCR 基因指紋技術以及2種或2種以上方法的結合，以上方法或操作復雜、耗時較長或需要PCR等儀器的支持，無法實現基層檢疫人員現場、快速檢疫的要求，不利于推廣。該試驗采用環介導等溫擴增技術(LAMP)，可以有效克服以上方法的不足，其反應過程僅需要金屬浴小型裝備的支持，且結果不需要通過電泳儀等設備可以直接目視或者加入熒光染料紫外照射觀察，這有效克服了試驗場地的限制。該研究結果表明，LAMP反應菌體檢測靈敏度高達3.6 CFU，現場檢測可以直接淋取菌液進行試驗，有效彌補其他分子生物學實驗菌體靈敏度不高，需提取基因組DNA進行檢測，減少了操作的復雜性；同時LAMP檢測反應時間縮短到30 min，大大提高了檢測的效率。

該試驗每個過程均重復3次，結果顯示該方法具有可靠的穩定性和較高的重復性。研究表明LAMP檢測玉米細菌性枯萎病菌體檢測靈敏度在1 CFU以下[24]，該試驗針對玉米內州萎蔫病菌的檢測靈敏度能否進一步提高還有待進一步研究。另外，雖然該試驗證實LAMP法反應具有很高的特異性，但針對玉米內州萎蔫病菌親緣關系相近的不同亞種，如Clavibactermichiganensissubsp.sepedonicus、Clavibactermichiganensissubsp.michiganensis的特異性仍需進一步驗證。

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