一株產細菌素乳酸菌的篩選及細菌素特性研究

一株產細菌素乳酸菌的篩選及細菌素特性研究

黎 杰，韓 磊，殷文政*

(內蒙古農業大學食品科學與工程學院，內蒙古呼和浩特 010018)

摘要[目的] 研究從酸馬奶酒中篩選出的1株產細菌素的乳酸菌的細菌素特性。[方法]從內蒙古地區酸馬奶酒中分離到19株乳酸菌，采用牛津杯雙層平板擴散法，排除有機酸、過氧化氫的干擾后，經蛋白酶敏感性試驗，篩選出1株產細菌素的乳酸菌菌株XMD6。[結果]通過形態學特征、生理生化試驗及16S rRNA基因序列分析，鑒定為堅強腸球菌(E.durans)。其所產細菌素在80 ℃對熱穩定，顯示抑菌活性pH范圍為2～7。抑菌譜試驗表明，該菌能抑制食品中常見的革蘭氏陽性、革蘭氏陰性的致病菌及腐敗菌，具有較廣的抑菌譜。[結論]研究可為今后開發利用新型細菌素防腐劑提供理論依據。

關鍵詞乳酸菌；篩選；細菌素；特性

中圖分類號S879.1

基金項目內蒙古自然科學

作者簡介黎杰(1988-)，男，重慶人，碩士研究生，研究方向：食品科學。*

收稿日期2015-06-03

Screening of Bacteriocin-producing Lactic Acid Bacteria and the Characteristics of Bacteriocin

LI Jie, HAN Lei, YIN Wen-zheng*(College of Food Science and Engineering, Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot, Inner Mongolia 010018)

Abstract[Objective] To study bacteriocin characteristics of lactic acid bacteria isolated from koumiss. [Method] Nineteen strains of lactic acid bacteria were isolated from koumiss in Inner Mongolia region. Through the Oxford cup double agar diffusion method, after eliminating the interference of organic acids and hydrogen peroxidea. Screening one strain of bacteriocin producing lactic acid bacteria strain XMD6 by the protease sensitivity test. [Result] The lactic acid bacteria was identified as E.durans by morphological, physiological and biochemical method and 16S rRNA gene sequence homology analysis. The bacteriocin of strain XMD6 heat-stable at 80 ℃, and pH in the range of 2-7 have antibacterial activity. The inhibitory spectrum test showed that it can inhibit the gram positive and gram negative pathogenic bacteria and spoilage bacteria in food, has a wider antibacterial spectrum. [Conclusion] The study can provide theoretical basis for development and utilization of new type bacteriocin preservative.

Key wordsLactic acid bacteria; Screening; Bacteriocin; Characteristics

細菌素(bacteriocin)是某些細菌在代謝過程中通過核糖體合成的一類具有抑菌活性的蛋白質或多肽[1-2]，能抑制食品中的多數腐敗菌和致病菌的生長繁殖[3]。化學防腐劑的亂用、濫用會在人體內毒素蓄積，而細菌素可被人體內蛋白酶降解，無任何殘留，無毒副作用，也不會產生抗藥性，是公認的天然食品防腐劑[4-5]。乳酸菌(lacticacidbacteria，LAB)是被證明了的食品安全級微生物(GRAS)，其發酵過程中產生有機酸、過氧化氫、細菌素等多種代謝產物。其中乳酸菌細菌素因其安全、無毒且有較強的抑菌活性，作為食品防腐劑具有廣闊的應用前景和市場價值，已成為國內外開發研究的熱點。在食品工業中應用乳酸菌細菌素替代化學防腐劑，將有利于改善食品安全現狀。目前為止，乳酸鏈球菌素(Nisin)是唯一允許作為防腐劑在食品生產加工中使用的細菌素，已在60多個國家和地區廣泛用于乳制品、肉制品、罐裝食品等的防腐保鮮中[6]。但Nisin的抑菌譜較窄，對pH的穩定性較差[7-8]，因而，Nisin在食品中應用范圍受到一定程度的限制。筆者從酸馬奶酒中篩選出1株產細菌素的乳酸菌，并對細菌素的特性進行初步研究，為今后開發利用新型細菌素防腐劑提供理論依據。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1樣品。采集自內蒙古錫林郭勒地區以傳統方法自然發酵的酸馬奶酒。

1.1.2指示菌。腸沙門氏菌亞種、熒光假單胞菌、枯草芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌，購于中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)；大腸桿菌購于美國典型菌種保藏中心(ATCC)；金黃色葡萄球菌、嗜熱鏈球菌，購于中國工業微生物菌種保藏管理中心(CICC)；單核細胞增生李斯特氏菌，購于中國醫學微生物菌種保藏管理中心(CMCC)；釀酒酵母、熱帶假絲酵母、黑曲霉，均由內蒙古農業大學微生物實驗室保藏。

1.1.3培養基。脫脂乳培養基、生理生化試驗培養基參照文獻[3，9]配制。MRS培養基、NA培養基、NB培養基、YPD培養基、PDA培養基，購于北京路橋技術有限公司。

1.2方法

1.2.1乳酸菌的分離、純化與保存。采用平板劃線法，對酸馬奶酒樣品中乳酸菌進行分離和純化，選取純菌株進行革蘭氏染色鏡檢及過氧化氫酶試驗，并將菌株于4 ℃保存備用。

1.2.2發酵上清液的制備。乳酸菌連續傳代培養3代，發酵液在4 ℃，8 000 r/min離心20 min，上清液用0.45 μm濾菌器過濾除去菌體，收集發酵上清液。

1.2.3抑菌試驗。采用牛津杯雙層平板擴散法[10]。具體方法為：在滅菌的平皿中注入約10 ml 2%的瓊脂培養基，使均勻鋪滿平皿底部作為下層，冷卻后在表面等間距放置滅菌的牛津杯，待NA培養基冷卻到50 ℃左右時，取200 μl指示菌菌懸液加入到20 ml培養基中，混勻后倒入下層有瓊脂的平皿中，待上層培養基冷卻后再將牛津杯取出，制成帶孔的含菌平板。將180 μl乳酸菌發酵上清液注入到小孔內，室溫下擴散4 h，在37 ℃恒溫培養12 h，取出后用游標卡尺測定抑菌圈直徑。抑菌試驗均重復3次。

1.2.4產抑菌物質乳酸菌的初篩。以沙門氏菌為指示菌，測定乳酸菌發酵上清液的抑菌活性。選取產生明顯抑菌圈的菌株進行復篩。

1.2.5產細菌素乳酸菌的復篩。有機酸的排除：將發酵上清液調pH至5.0，以用乙酸、乳酸調相同pH的MRS液體培養基對照組，對沙門氏菌抑菌試驗。

過氧化氫的排除：發酵上清液pH調至7.0，按濃度為10 mg/ml加入過氧化氫酶，37 ℃水浴2 h，再調回pH至5.0，以未加過氧化氫酶處理pH 5.0的發酵上清液作對照，進行抑菌試驗。

酶敏感性試驗：將發酵上清液分別調到各蛋白酶的最適pH 2.0、7.6、7.6、6.0和6.5，按終濃度1 mg/ml對應加入胃蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶K、木瓜蛋白酶和溶菌酶，在37 ℃水浴鍋中溫育2 h，再調回對照pH 5.0。以未用蛋白酶處理的pH 5.0發酵上清液作對照組，進行抑菌試驗。

1.2.6產細菌素乳酸菌的鑒定。形態學特征：觀察記錄乳酸菌的菌落特征及細胞形態。生理生化試驗：生理生化試驗參照文獻[11-13]的方法進行。16S rRNA基因序列分析：用細菌基因組DNA提取試劑盒對乳酸菌的基因組DNA進行提取，以其為模板進行PCR擴增16S rRNA基因序列。PCR擴增產物用1%瓊脂糖凝膠檢測，并送上海生工進行測序。將所測16S rRNA基因序列在提交到NCBI，用BLAST工具進行序列的同源性分析，并通過MEGA5.2軟件構建系統發育樹。

1.2.7細菌素的熱穩定性。將發酵上清液pH調至5.0，分別在40、60、80、100、121 ℃條件下加熱處理30 min，以未加熱處理的發酵液作對照，做抑菌試驗。

1.2.8細菌素對pH的穩定性。用2 mol/L的HCl和2 mol/L的NaOH將發酵上清液的pH分別調至2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0和11.0。分別測定不同pH下細菌素對指示菌的抑菌活性。

1.2.9抑菌譜的測定。發酵上清液pH調至5.0，分別對沙門氏菌、熒光假單胞菌、枯草芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、嗜熱鏈球菌、單核細胞增生李斯特氏菌、釀酒酵母、熱帶假絲酵母和黑曲霉做抑菌試驗，確定細菌素的抑菌譜。

2結果與分析

2.1乳酸菌的分離從酸馬奶酒中分離得到19株菌株，均革蘭氏染色呈陽性、過氧化氫酶試驗呈陰性，可初步判定為乳酸菌。

2.2產抑菌物質乳酸菌的初篩通過抑菌試驗，有4株乳酸菌的發酵上清液對沙門氏菌有明顯抑制作用，結果見表1。

表1　產抑菌物質乳酸菌初篩結果　mm

注：表中數值為3次試驗的平均值±標準誤差；牛津杯直徑8 mm。

2.3產細菌素乳酸菌的復篩對4株產抑菌物質乳酸菌進行復篩，通過排除有機酸、過氧化氫的干擾及酶敏感性試驗，篩選出1株產細菌素的乳酸菌，復篩結果如表2所示。

表2　乳酸菌XMD6的復篩結果　mm

注：表中數值為3次試驗的平均值±標準誤差；“-”，無抑菌圈；牛津杯直徑8 mm。

由表2可知，pH 5.0時，乙酸、乳酸對沙門氏菌均無抑制作用，發酵上清液的抑菌圈減小，仍有較強抑菌作用，表明有機酸有一定的抑制作用，但不是主要抑菌物質。過氧化氫酶處理的發酵上清液抑菌圈直徑基本沒變化，可排除過氧化氫的作用。發酵上清液經胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和蛋白酶K處理后，其抑菌活性部分或完全喪失，說明發酵上清液中的主要抑菌物質是蛋白類物質，可初步確認為細菌素。

2.4產細菌素乳酸菌的鑒定

2.4.1形態學特征。菌株XMD6的菌落呈圓形、乳白色、大小0.5～2.0 mm、邊緣整齊、表面光滑、質地均勻、有光澤、凸起、不透明。細胞形態為革蘭氏陽性球菌，呈圓形或橢圓，單個或成簇排列。

2.4.2生理生化試驗。乳酸菌XMD6的生理生化試驗結果見表3。由表3可知，菌株XMD6能發酵葡萄糖不產氣，10 ℃和45 ℃生長，在pH 9.6和6.5%NaCl也能生長，0.1%美蘭還原，不能發酵阿拉伯糖、山梨醇、棉子糖、蜜二糖、鼠李糖和蔗糖。根據《伯杰氏系統細菌學手冊》[11]和《常見細菌系統鑒定手冊》[13]可初步鑒定為堅強腸球菌(Enterococcusdurans)。

表3　乳酸菌XMD6生理生化試驗結果

注：“+”，90%以上菌株為陽性；“-”，90%以上菌株為陰性；“d”，11%～89%菌株為陽性。

2.4.316S rRNA基因序列分析。PCR擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳檢測結果(圖1)。由圖1可知，PCR擴增產物得到一條清晰的條帶，大小約1 500 bp。

將菌株XMD6測得的 16S rRNA基因序列與GenBank中已知菌株的基因序列進行同源性比較，并構建系統發育樹(圖2)。由圖2可知，菌株XMD6與標準菌株Enterococcusduransstrain DSM 20633的同源性最高，達到100%。結合生理生化試驗及16S rRNA基因序列分析，該菌為堅強腸球菌(Enterococcusdurans)，命名為E.duransXMD6。

2.5細菌素的熱穩定性發酵上清液經不同溫度處理后的抑菌結果見表4。由表4可知，E.duransXMD6產的細菌素在經80 ℃處理30 min后，抑菌圈大小基本不變，121 ℃處理30 min，仍有抑菌活性，可以判定該細菌素具有良好的熱穩定性。

表4　不同溫度對細菌素抑菌活性的影響　mm

注：表中數值為3次試驗的平均值±標準誤差；牛津杯直徑8 mm。

2.6細菌素的pH穩定性不同pH對發酵上清液抑菌活性的影響結果如圖3所示。由圖3可以看出，E.duransXMD6產的細菌素在pH 2～7的范圍內有抑菌活性，其抑菌活性隨pH的升高而逐漸降低，pH在8～11范圍內無抑菌活性，說明E.duransXMD6產的細菌素酸性條件下有較好的穩定性。

2.7抑菌譜的測定發酵上清液對11株指示菌的抑菌結果如表5所示。由表5可知，E.duransXMD6產的細菌素能抑制金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌等革蘭氏陽性細菌以及沙門氏菌、大腸桿菌革蘭氏等革蘭氏陰性細菌，具有廣譜抑菌作用。

表5　細菌素的抑菌譜

注：“+++”，直徑>15 mm；“++”，11 mm<直徑<15 mm；“+”，8 mm<直徑<11 mm ；“-”，無抑菌圈。

3結論

該研究從酸馬奶酒中分離出19株乳酸菌，排除有機酸、過氧化氫的干擾后，經蛋白酶敏感性試驗，篩選出1株產細菌素的乳酸菌菌株XMD6。結合形態學特征、生理生化反應及16S rRNA基因序列分析，將其鑒定為Enterococcusdurans，并命名為E.duransXMD6。

目前，已發現的乳酸菌細菌素有300多種，其產生菌株集中在乳球菌屬、片球菌屬、乳桿菌屬、腸球菌屬等[14-16]。腸球菌屬中以屎腸球菌研究最多[17]，堅強腸球菌產細菌素還未見報道。E.duransXMD6產的細菌素對蛋白酶敏感，有良好的熱穩定性，80 ℃處理30 min抑菌活性基本不變，可用于巴氏殺菌食品的生產加工中，具有廣闊的應用前景。此外，E.duransXMD6產的細菌素在pH 2～7的范圍內顯示抑菌活性，抑菌活性隨pH增大而降低，這可能是因為高酸性條件可促進細菌素的抑菌活性或細菌素和酸共同的作用，有待繼續研究，因此，可將其用于酸性食品的防腐保鮮中。一般情況下，細菌素只能抑制同種或親緣關系很近的細菌，而該試驗篩選的E.duransXMD6產的細菌素，對食品中常見的革

蘭氏陽性和陰性腐敗菌及致病菌都有很好的抑制效果，具有較廣的抑菌譜。

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