組織芯片分析PRSS2蛋白在胃癌組織中的表達與意義

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(1.南華大學附屬第一醫院病理科,湖南 衡陽 421001;2.南華大學醫學院腫瘤研究所,腫瘤細胞與分子病理學湖南省高校重點實驗室;3.湖南省胃癌研究中心;4.南華大學附屬第二醫院耳鼻喉科;5.邵陽醫學高等?？茖W校附屬醫院病理科;6.衡陽市中心醫院急診科;7.南華大學醫學院臨床醫學卓越醫師班)

·基礎醫學·

組織芯片分析PRSS2蛋白在胃癌組織中的表達與意義

趙強1,3,張志偉2,3*,肖娟4,劉重元1,伍石華2,5,李臻6,雷明生7,楊代水7,權里平7,舒友成7

(1.南華大學附屬第一醫院病理科,湖南 衡陽 421001;2.南華大學醫學院腫瘤研究所,腫瘤細胞與分子病理學湖南省高校重點實驗室;3.湖南省胃癌研究中心;4.南華大學附屬第二醫院耳鼻喉科;5.邵陽醫學高等?？茖W校附屬醫院病理科;6.衡陽市中心醫院急診科;7.南華大學醫學院臨床醫學卓越醫師班)

目的采用組織芯片分析PRSS2蛋白在胃癌組織中表達與意義，為獲取胃癌診斷相關的蛋白分子提供實驗資料。方法首先收集8例胃癌手術切除標本，包括正常胃粘膜、癌旁組織與胃癌組織，選用Western-blotting方法檢測PRSS2蛋白在正常胃粘膜、癌旁組織與胃癌組織中的表達；其次運用免疫組織化學染色方法觀察組織芯片(包括正常胃粘膜、癌旁和胃癌組織)中PRSS2蛋白在胃癌組織中的表達，分析其臨床意義。結果胃癌組織中PRSS2蛋白表達較正常胃粘膜和癌旁組織明顯升高，癌旁組織中的表達較正常胃粘膜組織升高；正常胃粘膜、癌旁和胃癌組織中PRSS2蛋白的陽性表達率分別為14.29%(5/34)、26.92%(7/26)和77.78%(63/81)，在胃癌組織中高分化、中分化和低分化腺癌的陽性表達率分別為60.00%(3/5)、70.59%(12/17)和81.36%(48/59)；PRSS2蛋白的陽性表達與胃癌組織的分化程度也呈現負相關。結論PRSS2蛋白在胃癌組織中表達較正常胃粘膜和癌旁組織高，癌旁組織中的表達較正常胃粘膜組織高，該蛋白表達與胃癌組織的發生和分化程度有關。

胃癌； PRSS2蛋白； 蛋白表達； 分化程度

胃癌是我國最常見的惡性腫瘤之一[1,2]。近年來，我國胃癌發病率呈逐漸下降趨勢，但呈現年輕化趨勢，仍嚴重威脅著人們的健康與生命[3-5]。早期診斷是目前防治胃癌的關鍵，因此尋找高效、敏感的胃癌診斷標記物，對提高胃癌早期診斷，改善整體療效，延長患者生命具有十分重要的意義。本研究旨在分析PRSS2蛋白在胃癌中表達與意義，為胃癌早期診斷及評估患者預后提供有價值的資料。

1 材料與方法

1.1材料收集8例南華大學附一醫院胃癌手術切除標本，其中男性7例，女性3例，年齡38～72歲，平均年齡約48歲。標本收集時以距癌灶10 cm以上者為正常胃粘膜組織(經病理確診為正常胃粘膜組織)，距癌灶3～5 cm者為癌旁組織(經病理確診為非典型增生或伴腸上皮化生的胃粘膜組織)。上述所有患者術前均未進行化療或放療，所有標本均經病理確診。

組織芯片由湘潭市第一人民醫院病理科吳勇軍主任醫師制作贈送。芯片中包括正常胃粘膜、癌旁與胃癌組織，芯片中組織樣本取自2003年～2009年湘潭市第一人民醫院手術切除胃癌標本81例，其中高分化腺癌5例、中分化腺癌17例、低分化腺癌59例。所有胃癌患者中男性56例，女性25例，年齡27～81歲，平均年齡為55.35歲；芯片中另有34例正常胃粘膜對照(經病理確診)，芯片包括5×10個點陣，芯片中包含的所有組織均經病理確診[5]，患者也未進行化療或放療。鼠抗人PRSS2蛋白抗體購自上海優寧維生物科技有限公司，SP免疫組化檢測試劑盒均購自福建邁新生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 Western-blotting 將收集組織加入組織裂解液后，在勻漿器中研磨，制備總蛋白液，測定濃度后，以各泳道50 μg的總蛋白進行10% SDS不連續聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉膜、封閉，一抗(1∶1 000)及抗β-actin單體(1∶2 000)4 ℃孵育過夜，洗膜后，HRP標記的羊抗兔二抗(1∶1 000)孵育、洗膜、發光、曝光、顯影、定影以及分析結果。

1.2.2 免疫組織化學染色 操作按照超敏SP試劑盒所附說明書進行，用已知陽性片作陽性對照(福建邁新生物有限公司提供)，同時用PBS替代第一抗體作陰性對照，實驗步驟如下：將制備好的石蠟切片58 ℃隔水式恒溫培養箱中過夜；二甲苯脫蠟2次后水化，PBS洗片3次，每次3 min；將切片浸入盛有枸椽酸鹽緩沖液容器中微波爐加熱進行抗原修復；加3%過氧化物酶阻斷液，37 ℃ 15 min，PBS洗片3次，每次3 min；加足量非免疫性動物血清，37 ℃ 10 min，阻斷非特異性結合位點；分別滴加一抗，置濕盒中4 ℃冰箱過夜；滴加生物素標記的二抗，37 ℃ 15 min；滴加鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶溶液，37 ℃ 15 min； DAB顯色、蘇木素復染、返藍、脫水、透明、封片、顯微鏡觀察、照相(結果陽性部位呈棕黃色)。

1.2.3 免疫組織化學染色結果判定 組織芯片中黃色、棕色、棕褐色部位為蛋白陽性表達。選取五個不重復視野，記數組織中細胞總數與陽性表達細胞數，計算陽性表達率。蛋白表達結果的判定，按染色強度與陽性細胞數占細胞總數的百分比綜合計分[2-4]。染色強度：無色者為1分，黃色者為2分，棕褐色者為3分；陽性細胞數：≤總數的10%者為1分；11%～50%者為2分；>50%者為3分。將染色強度分值與陽性細胞數分值相乘，1分者為陰性“-”；2～4分者為陽性“+”，≥6分者為強陽性“+++”，其中陽性細胞數>l0%者為陽性表達。

1.2.4 統計學處理 采用SPSS17.0統計軟件對所有數據進行統計處理和分析。選用χ2檢驗分析PRSS2蛋白的表達與不同胃組織臨床資料的關系，以P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 Western-blotting檢測PRSS2蛋白的表達PRSS2蛋白在胃癌組織中的表達較正常胃粘膜和癌旁組織低。同時，癌旁組織中PRSS2蛋白表達較正常胃粘膜組織低(圖1)。

圖1 PRSS2蛋白的表達 1：正常胃粘膜；2：癌旁組織；3：胃癌組織

2.2免疫組織化學染色觀察PRSS2蛋白的表達

采用免疫組織化學染色檢測PRSS2蛋白在組織芯片中的表達。結果顯示PRSS2蛋白表達主要位于細胞漿(圖2)。

圖2 免疫組織化學檢測組織中PRSS2蛋白表達代表切片A：正常胃粘膜(-)；B：癌旁組織(+)；C：高分化腺癌(++)；D：中分化腺癌(+++)；E：低分化腺癌(+++).A1、B1、C1、D1和E1放大倍數為40倍；A2、B2、C2、D2和E2放大倍數為400倍

2.3 PRSS2蛋白表達情況的分析根據免疫組織化學染色結果，分別計算PRSS2蛋白在不同類型組織中的陽性表達率。PRSS2蛋白在正常胃粘膜、癌旁組織及胃癌組織中的陽性表達率分別為14.29%(5/34)、26.92%(7/26)和77.78%(63/81)。胃癌組織中PRSS2蛋白的陽性表達率較正常胃粘膜和癌旁組織高。同時，癌旁組織中PRSS2蛋白的陽性表達率較正常胃粘膜組織高(表1，P<0.01)。胃高分化、中分化和低分腺癌中PRSS2蛋白的陽性表達率分別為60.00%(3/5)、70.59%(12/17)和81.36%(48/59)，結果提示，PRSS2蛋白的表達與胃癌的發生及分化程度有關，即該蛋白在胃癌組織中高表達，且癌組織分化程度降低，其表達增加。

表1不同組織中PRSS2蛋白的表達情況

組 別nPRSS2蛋白表達-+^+++陽性率(%)正常胃粘膜3425514.29癌旁組織2619726.92a胃癌組織 高分化腺癌52360.00ab 中分化腺癌1751270.59abc低分化腺癌59114881.36abcd

與正常胃粘膜組比較，a:P<0.01；與癌旁組織比較，b:P<0.01；與高分化腺癌比較，c:P<0.01；與中分化腺癌比較，d:P<0.01

3 討 論

近年來，人們對胃癌的早期診斷做了大量的系統研究，使胃癌的早期篩查、診斷與治療水平均取得了一定程度的提高，但臨床療效仍有待進一步改觀。現已有一些胃癌診斷分子標記物應用臨床的診斷與治療，如CA19-9[6]、CEA[7]、Span-1[8]等，但它們針對胃癌早期診斷的應用效果尚有待分析。近年來，隨著蛋白組學技術的不斷發展，許多胃癌相關蛋白被不斷的發現，為獲取胃癌早期診斷的標志物提供了可能。

胰蛋白酶原2(PRSS2)是一種絲氨酸蛋白酶，許多研究均證實其和多種惡性腫瘤密切相關，因此PRSS2也稱為腫瘤相關胰蛋白酶原2(PRSS2)。PRSS2具有以下特征[9-11]：多種惡性腫瘤細胞株和人體惡性腫瘤中均表達該蛋白，其表達與腫瘤的侵襲與轉移機制有關，可直接或間接地水解腫瘤周圍基質蛋白，促進腫瘤細胞的侵襲與轉移，其抑制劑可抑制腫瘤侵襲，多產生于胰腺外的器官或組織。PRSS2是基質金屬蛋白酶(MMP)的激活物，能激活間質膠原酶(MMP-1、8和13)，導致腫瘤細胞周圍的膠原蛋白降解，促進腫瘤細胞的侵襲和轉移[12]。基于PRSS2蛋白的功能，結合我們在胃癌組織中的檢測結果，胃癌組織中該蛋白的表達與其分化程度成負相關，即惡性程度高的低分化腺癌呈現高表達，低分化腺癌臨床常表現易發生侵襲與轉移，其在轉移過程中需要PRSS2蛋白水解癌細胞周圍的基質蛋白、血管壁組織、淋巴管組織，有利于癌細胞的浸潤、轉移。因此，臨床檢測該蛋白在癌組織中的表達水平，可分辨癌細胞的惡性程度與轉移能力，對預測評估患者的預后具有十分重要的意義。

PRSS2蛋白能夠激活蛋白酶激活受體，促進腫瘤的生長發育[9,10]。有研究報道[13]，結直腸腫瘤組織PRSS2的表達較其周圍的正常粘膜組織明顯上調。我們在胃癌組織中檢測該蛋白得到了類似的結果，即PRSS2蛋白在癌組織中高表達，在非典型增生的胃粘膜也高于正常粘膜組織，結果提示該蛋白在胃粘膜癌變過程中呈現逐漸上調的現象。另外，許多研究顯示，多種腫瘤患者體內呈現血清PRSS2蛋白的高水平，檢測血清中該蛋白的變化，可預測體內腫瘤的進展情況[14]。因此，觀察PRSS2蛋白在胃癌組織與患者體內血清蛋白的水平，了解該蛋白的改變情況，有望監測患者體內胃癌的進展情況。由于血清檢測的簡單、便捷，深入揭示該蛋白在胃癌發生與發展中的作用，有望成為胃癌早期診斷與檢測胃癌發展的蛋白分子。因胃癌發生發展的多基因與多因素參與的復雜性，以及本次研究樣的本量有限，臨床應用前仍需擴大檢測樣本進行分析與評估。

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SignificanceandExpressionofPRSS2ProteinsAnalyzedbyTissueArrayinGastricCancerTissue

ZHAO Qiang,ZHANG Zhiwei,XIAO Juan,et al

(DepartmentofPathology,theFirstAffiliatedHospital,UniversityofSouthernChina,Hunan,Hengyang421001,China)

ObjectiveThe significance and expression of PRSS2 protein was analyzed by tissue array in gastric cancer tissue and provide valuable data for finding diagnosis related protein of gastric cancer.MethodsThe 8 cases including normal gastric mucosa,cancer side tissue and gastric cancer were respectively collected.The expression of PRSS2 proteins was checked by Western-blotting.Then,the expression of PRSS2 protein was detected in gastric tissue arrays including normal gastric mucosa,cancer side tissue and gastric cancer by immunohistochemistry staining.The clinical pathology significance of expression of PRSS2 protein was analyzed in gastric cancer tissue.ResultsThe expressions of PRSS2 protein was higher in gastric cancer tissue than that in normal gastric mucosa and cancer side tissue.It was higher in cancer side tissue than that in normal gastric mucosa.The expression positive rates of PRSS2 protein were 14.29% (5/34),26.92% (7/26) and 77.78% (63/81) in normal gastric mucosa,cancer side tissue and gastric cancer tissue,respectively.The expressiong of PRSS2 was 60.00% (3/5),70.59% (12/17) and 81.36% (48/59) in gastric well differentiated,middle differentiated and poorly differentiated adenocarcinoma,respectively.(P<0.01).There are negative relation between tissue differentiation level of gastric cancer and the expression positive rate of PRSS2(P<0.01).ConclusionThe expression positive rate of PRSS2 protein was higher in gastric cancer tissue than that in normal gastric mucosa and cancer side tissue and higher in cancer side tissue than in normal gastric mucosa tissue.The expression of PRSS2 protein was related with effluence and differentaiation level of gastric cancer tissue.

Gastric cancer; PRSS2 protein; protein expression; differentaiation level

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2015.03.002

2014-10-09；

2015-02-05

湖南省自然科學衡陽聯合基金(12JJ9033)；湖南省自然科學基金(12JJ3102、13JJ3079)；湖南省科技廳項目(2013SK3118、2014SK3081)；湖南省高校創新平臺基金(12K094、13K082、13K083)；湖南省教育廳課題(11C1112、12C0340)；衡陽市科技局項目(2013KJ12、2013KJ28)；邵陽市科技局重點項目(2013SK13)；湖南省衛生廳項目(B2013-048、B2014-163).

*通訊作者，E-mail:nhdxzzw@qq.com.

R735.2

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(此文編輯：秦旭平)