利用微衛星標記分析長白山中華蜜蜂遺傳多樣性

高夫超

（黑龍江省農科院牡丹江分院，157041）

利用微衛星標記分析長白山中華蜜蜂遺傳多樣性

高夫超

（黑龍江省農科院牡丹江分院，157041）

利用21對微衛星標記對吉林長白山中華蜜蜂群體遺傳多樣性進行分析，共檢測到39個等位基因，等位基因數目從1～5不等。平均等位基因數為1.8571；所有位點的平均期望雜合度（He）和平均多態信息含量（PIC）值分別為0.2068和0.1679。表明長白山中華蜜蜂群體遺傳多樣性較低。

中華蜜蜂；微衛星；遺傳多樣性

中華蜜蜂(Apis cerana cerana)是我國特有的蜜蜂遺傳資源，公認它有5個生態型[1]。長白山中蜂屬于其中的東北生態型，主要分布在長白山區東部的高海拔區和中、西部低海拔淺山地帶，歷經數千年的繁盛時期，長白山中蜂有其獨特的形態學、生物學和生產性狀，一直以來都是本地蜂業生產中的佼佼者，深受廣大養蜂愛好者的青睞[2]。

遺傳多樣性(genetic diversity)一般指品種內個體在DNA水平上的千差萬別。通過對遺傳多樣性的研究，可了解品種的遺傳結構、生活背景，分析其進化的歷史和潛力，以及探討品種瀕危的原因和現狀，提出合理的保種措施[3]。微衛星標記作為一種有效的評價動物遺傳資源的分子標記，具有分布廣泛、多態信息含量高、呈共顯性遺傳及檢測快速方便等優點，已經被成功地用于畜禽遺傳變異及品種間遺傳關系的研究，同時在構建遺傳連鎖圖譜、評價遺傳多樣性和群體進化、繪制系統發生樹、血緣關系鑒定、核基因組研究以及基因定位等研究中得到廣泛的應用[4-5]。聯合國糧農組織（FAO）將微衛星標記作為優先推薦的遺傳資源分析工具[6]。目前微衛星標記分析已經成為群體遺傳結構、遺傳多樣性研究中最普遍最有效的手段之一，但關于中蜂(Apis cerana cerana)微衛星DNA遺傳多樣性的研究還相對較少。本試驗采用21對微衛星引物從DNA水平上分析長白山中蜂群體遺傳多樣性，評估其群體遺傳結構，以期能夠為正確評價和合理保護利用其遺傳資源提供科學的理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

樣本采集于吉林長白山地區，共30群。DNA提取參照吉挺[7]所建立的方法。提取的DNA用紫外分光光度計測定其濃度和純度，-20℃保存備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 微衛星標記的選擇

21對微衛星引物信息列于表1，引物序列參考NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)等網站和Michel Solignac等[8]報導。

表1 21個微衛星座位的位置和單個引物的PCR反應條件

1.2.2 PCR反應條件

PCR反應體系共20 μL：50 ng/μL DNA模板1 μL，10×buffer 2.0 μL，25 mmo1/L MgCl21.6～2.2 μL(因基因座而異)，10 mmol/μL的dNTP 0.5 μL，10 pmo1/μL的引物各1μL，5 U/μL Taq DNA聚合酶0.2 μL，用超純水補足20 μL。

擴增程序為95℃預變性5 min；95℃變性50 s，50～60℃復性50 s，72℃延伸50 s，30個循環；最終72℃延伸10 min。

1.2.3 基因型判定

特異的擴增產物經8%聚丙烯酰胺凝膠電泳，用銀染法顯影、定影。Kodak成像系統拍照保存圖片。利用Kodak Digital Science ID Image Analysis Software根據PBR322/Msp I Marker為標準計算擴增片段的大小。

1.3 統計方法

利用Microsatellite-Toolkit軟件[9]計算等位基因頻率與期望雜合度。根據Botstein等[10]的公式計算每一個群體每一個位點的多態信息含量。

n為等位基因數，pi為第i個等位基因的基因頻率，pj為第j個等位基因的基因頻率。

2 結果與分析

2.1 長白山中蜂21個微衛星擴增結果

用21對微衛星引物對長白山中蜂群體基因組DNA模板進行PCR擴增，擴增結果見表2。結果顯示共檢測到144個等位基因。單個位點的等位基因數從2（A024d、A035）到12（AC011）不等，平均為5.76。At003位點則擁有最高的期望雜合度和PIC值，為0.8881和0.8604。

2.2 長白山中蜂21個微衛星座位等位基因頻率

根據各位點不同基因型數目計算出長白山中蜂21個微衛星座位的等位基因頻率，結果見表3。

3 討論

本研究21個微衛星位點分布于中蜂的14條染色體上，覆蓋了中蜂基因組85%以上的染色體，因此能夠較好地反映長白山中蜂的遺傳多樣性，具有較高的可信性。

等位基因數量反映了某個基因座在進化過程中所積累的遺傳變異，等位基因數量越多說明進化歷史上這個基因座突變越活躍，導致物種在自然選擇中發展的取向越多，對生活環境適應的潛能越大。從本試驗結果來看，長白山中蜂21個微衛星座位中共檢測到39個等位基因，平均等位基因數為1.8571個，最高為5個，最低為1個，表明這些微衛星座位多態性較低。

多態信息含量(PIC)是衡量基因片段多態性較好的指標，當PIC＞0.5時，該座位為高度多態性座位；0.25＜PIC＜0.5時，為中度多態性座位；PIC＜0.25時，為低度多態性座位[11]。同時多態信息含量關系到該座位可用性及使用效率，多態信息含量越大，在一個群體中，該座位雜合子比例則越大，提供的遺傳信息就越高。本研究中有1個位點處于高度多態，6個位點屬于中度多態性位點，4個位點屬于低度多態性位點，10個位點無多態性，平均PIC值為0.1679，說明這21個微衛星位點在長白山中蜂群體中所提供的多態信息含量較低，用以分析其遺傳多樣性具有較高的有效性和可靠性。

基因雜合度也稱為基因多樣度，一般認為它是度量群體遺傳變異的一個最適參數，其值越大說明群體遺傳變異越大，反之，則越小。澤格.歐特將多態位點定義為雜合度至少為0.10的位點[12]，本研究所分析的21個微衛星標記中，11個位點均有較高的多態性（均高于0.10），占52.38%，10個位點為0，占47.62%。群體遺傳多樣性較低，選擇潛力較低，今后可將它們作為候選遺傳標記用于性狀和標記間的連鎖分析，并對種質保存提供參考。平均基因雜合度大小近似的反映出遺傳結構變異程度的高低。吉挺等[13]使用8對微衛星標記對江蘇省中華蜜蜂進行遺傳多樣性研究，宜興中蜂的8個位點的期望雜合度為0.4424，本研究中長白山中蜂21個微衛星座位的平均基因雜合度為0.2068，低于宜興中蜂，顯示出較低的遺傳多樣性和選擇潛力。

表2 長白山中蜂21個微衛星標記等位基因數、等位基因大小、平均期望雜合度、多態信息含量

表3 各位點等位基因頻率

本研究結果表明，長白山中蜂的群體遺傳變異較小，多態信息含量較低，說明其近交程度較高。但在對其進行品種進行長期保存時，需要保持一定的規模，并運用有效的保種措施，如建立自然保護區等，保護種質基因資源，防止有利基因的丟失。

[1]龔一飛,張其康.蜜蜂分類與進化[M].福州:福建科技出版社, 2002.19-21.

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[5]屠云潔,陳寬維,湯青萍,等.江西4個地方鵝品種遺傳多樣性的微衛星標記分析[J].揚州大學學報:農業與生命科學版, 2006,27(1):33-37.

[6]Baker J S F.A global protocol for determining genetic distance among domestic livestock breeds.In:Proceedings of the 5th world congress on genetics applied to livestock production,1994,21: 501-508.

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[12]Jurg Ott.Analysis of Human Genetic Linkage(revised edition). Baltimore:Johns Hopkins UniversityPress,2001.

[13]吉挺,陳晶,殷玲,等。江蘇省野生及家養中華蜜蜂微衛星DNA遺傳多樣性分析[J].中國畜牧獸醫,2007,34(12):39-41.

Study on Genetic Diversity of Apis cerana cerana Populations from Changbai Mountain by Microsatellite Makers

Gao Fuchao
（Mudanjiang Branch of Heilongjiang Academy of Agriculture Science,157041 China）

Genetic diversity of Apis cerana cerana Populations from Changbai Mountain in Jilin province was evaluated with 21 microstaellite makers.The results showed that,39 alleles were found in 21 microstaellite loci,the number of alleles per locus ranged from 1 to 5,mean number of effective alleles was 1.8571,the average expected heterozygosity and PIC of all loci were 0.2068 and 0.1679,respectively.These results indicated that the Apis cerana cerana populations from Changbai Mountain had low level of genetic diversity.

Apis cerana cerana;microsatellite markers;genetic diversity

國家蜂產業技術體系專項資金（CARS-45-SYZ5）

高夫超，男（1965-），副研究員，主要從事蜂學方面的研究。E-mail:mdjgfc@126.com.