簡(jiǎn)易細(xì)胞塊和細(xì)胞芯片的制作方法及應(yīng)用價(jià)值

曾宇婷，吳共發(fā)，林俊汕，鄭娜芬，韓靜靜，黃綺亭，區(qū)瑞章，李海剛,增城市人民醫(yī)院/中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院增城院區(qū)病理科，廣東 廣州 5300；中山大學(xué)附屬孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院病理科，廣東 廣州 500

細(xì)胞塊的制作方法已經(jīng)有不少報(bào)道，包括利用凝血酶［1］、瓊脂糖［2］或雞蛋清［3，4］進(jìn)行包埋，或離心沉淀法［2，5］，但前兩者需要特殊物質(zhì)進(jìn)行包埋，不利于就地取材原則，而離心沉淀法在標(biāo)本有黏液等情況時(shí)細(xì)胞會(huì)不成團(tuán)導(dǎo)致制作失敗。細(xì)胞芯片是生物芯片中的一種，具有類(lèi)似組織芯片的功能，有針對(duì)科研實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞芯片制作方法[6-7]，但不適用于臨床細(xì)胞標(biāo)本；有利用組織芯片原理制作細(xì)胞芯片的報(bào)道［8-9］，但這些方法同樣存在某些不足，如需要專(zhuān)門(mén)設(shè)備，技術(shù)要求高；有研究者發(fā)明了細(xì)胞芯片制備儀并申請(qǐng)了專(zhuān)利［10］，但該制備儀尚需技術(shù)完善、有專(zhuān)利保護(hù)，尚未得到推廣應(yīng)用。本研究采用簡(jiǎn)易方法制作細(xì)胞塊和細(xì)胞芯片，收到了滿(mǎn)意的效果，本文就制作過(guò)程中的主要技術(shù)環(huán)節(jié)和應(yīng)用體會(huì)介紹如下。

1 材料與方法

1.1 材料

收集2013年12月～2014年6月增城市人民醫(yī)院和中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院臨床各科室送檢的細(xì)胞學(xué)標(biāo)本，其中胸腔積液38例，腹腔積液26例，EP管、離心管、磷酸鹽緩沖液（PBS）、各種即用型免疫組化抗體、即用型二步法免疫組化廣譜檢測(cè)試劑盒和DAB顯色劑均購(gòu)自福州邁新公司；細(xì)胞原位凋亡檢測(cè)試劑盒（TUNEL assay）購(gòu)自瑞士Roche Diagnostics；其他耗材和儀器均為病理科日常工作所需。

1.2 細(xì)胞塊制作

細(xì)胞學(xué)標(biāo)本直接移入50 ml離心管，2000 r/min離心10 min，去掉液體，加入6～10 ml醋酸消化液（消除粘液和紅細(xì)胞），振動(dòng)器震蕩10 min，2000 r/min離心10 min，去掉液體，如果細(xì)胞團(tuán)塊過(guò)大，可分裝至其他EP管，調(diào)整細(xì)胞沉淀團(tuán)塊直徑約3 mm，加入95%乙醇，2000 r/min離心10 min，去掉上清，輕輕加入4%中性緩沖甲醛，2000 r/min離心10 min，用病理切片刀將EP管底部切開(kāi)，小鑷子輕輕將細(xì)胞塊頂出，包在擦鏡紙并染伊紅，放入包埋盒中，進(jìn)行常規(guī)沖洗、脫水、透明、浸蠟。

1.3 細(xì)胞芯片制作

將浸蠟后待包埋的各細(xì)胞塊和不銹鋼包埋模一同放入熔融的石蠟缸中，小心按照預(yù)先編排好的位置將細(xì)胞塊排列在不銹鋼包埋模，輕輕將包埋盒蓋在不銹鋼包埋模上（圖1），用小鑷子鉗住包埋模邊緣，保持不銹鋼包埋模與地平線(xiàn)平行，將其平穩(wěn)地取出蠟缸，放置于與地平線(xiàn)平行的臺(tái)面，待其凝固后即制出細(xì)胞芯片。注意操作全過(guò)程要小心謹(jǐn)慎，動(dòng)作平穩(wěn)，以免碰亂細(xì)胞塊排列順序。

圖1 細(xì)胞芯片制作示意圖

1.4 常規(guī)HE染色、免疫細(xì)胞化學(xué)和TUNEL檢測(cè)

細(xì)胞塊及細(xì)胞芯片均行HE染色，方法與組織常規(guī)HE染色相同。蠟塊3μm厚切片行免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)，方法與組織學(xué)免疫組化相同，操作按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。TUNEL檢測(cè)操作步驟參照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，方法與石蠟組織的TUNEL檢測(cè)過(guò)程相同。

2 結(jié)果

2.1 HE染色效果

HE染色顯示細(xì)胞塊及細(xì)胞芯片中的各種細(xì)胞著色清晰，細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核顯示良好，背景干凈，鏡下易于觀(guān)察（圖2A）。

2.2 免疫細(xì)胞花學(xué)染色和TUNEL檢測(cè)效果

免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示細(xì)胞塊及細(xì)胞芯片中的各種抗體在細(xì)胞染色表達(dá)位置正常，染色效良好（圖2B～C）。TUNEL檢測(cè)結(jié)果顯示細(xì)胞質(zhì)染成淡棕黃色，發(fā)生凋亡的細(xì)胞核呈棕褐色，未發(fā)生凋亡的細(xì)胞核經(jīng)過(guò)蘇木素染色后呈藍(lán)色（圖2D）。

圖2 細(xì)胞塊及細(xì)胞芯片應(yīng)用價(jià)值

3 討論

細(xì)胞病理檢查已廣泛用于幫助臨床診斷腫瘤性病變。目前漿膜腔積液常規(guī)使用離心涂片法制片，制出的片質(zhì)量欠佳，且不能進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)檢查，影響了細(xì)胞學(xué)檢查的進(jìn)一步發(fā)展。細(xì)胞塊的出現(xiàn)很好的解決了免疫細(xì)胞化學(xué)檢查的問(wèn)題。細(xì)胞塊的制作方法包括利用某種特殊物質(zhì)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行包埋，如凝血酶［1］、瓊脂糖［2］雞蛋清［3，4］，或者離心沉淀法［2，3］，利用特殊物質(zhì)進(jìn)行包埋雖然方法可行，但不利于就地取材原則，而離心沉淀法在標(biāo)本有黏液等情況時(shí)細(xì)胞會(huì)不成團(tuán)導(dǎo)致制作失敗。本研究在實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)離心沉淀法在標(biāo)本具有黏液、壞死物、較多紅細(xì)胞等時(shí)才會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞無(wú)法成團(tuán)，為此在此法基礎(chǔ)上加入醇酸消化液步驟，經(jīng)過(guò)醋酸消化后的標(biāo)本均能離心成團(tuán)制成細(xì)胞塊，而醋酸消化液是宮頸TCT制片等必須的試劑，取用方便，無(wú)需特殊購(gòu)買(mǎi)。

細(xì)胞塊存在某些不足之處，例如一次只能檢測(cè)一個(gè)標(biāo)本，當(dāng)許多標(biāo)本需要檢測(cè)時(shí)，則需要逐個(gè)檢測(cè)，浪費(fèi)人力物力和時(shí)間。并且當(dāng)標(biāo)本量多時(shí)，對(duì)多張切片進(jìn)行實(shí)驗(yàn)易造成人為誤差的出現(xiàn)，影響結(jié)果的客觀(guān)性及準(zhǔn)確性。而細(xì)胞芯片的出現(xiàn)彌補(bǔ)了細(xì)胞塊這些缺陷。本研究從細(xì)胞塊具有體積小的特點(diǎn)，摸索出一種簡(jiǎn)便的手工制備細(xì)胞芯片方法。該方法所需耗材、試劑、儀器均為日常病理科所具備，將細(xì)胞學(xué)標(biāo)本按照上述方法制成細(xì)胞塊后，將浸蠟的細(xì)胞塊按照預(yù)先設(shè)計(jì)好的位置排列在包埋模上，待石蠟?zāi)毯蠹纯芍谱鞒鍪灱?xì)胞芯片，整個(gè)流程具有非常好的可靠性和穩(wěn)定性、操作簡(jiǎn)單方便、不需要特殊儀器、價(jià)格低廉。制作出來(lái)的細(xì)胞芯片點(diǎn)陣完整，排列均一，熟練操作后可以制備出多至60個(gè)點(diǎn)陣的芯片，經(jīng)過(guò)驗(yàn)證，證實(shí)各細(xì)胞結(jié)構(gòu)保存良好、染色細(xì)胞顏色鮮艷，染色效果良好，免疫組化染色及TUNEL染色的陽(yáng)性表達(dá)效果好，背景清晰，抗原保存良好，具有與石蠟組織一樣能永久保存的特點(diǎn)。

此法有幾個(gè)需要注意的環(huán)節(jié)。首先標(biāo)本要加入醋酸消化液，特別是對(duì)血性、渾濁或帶黏液的標(biāo)本要充分消化，這樣細(xì)胞才能成團(tuán)，消化干凈的判斷方法是細(xì)胞塊肉眼觀(guān)察質(zhì)地緊實(shí)，與EP管交界邊緣銳利；另外細(xì)胞塊大小以直徑3 mm為宜，太小則可咨診斷的細(xì)胞信息少，過(guò)大則在制作細(xì)胞芯片是比較占空間；初學(xué)者在制作細(xì)胞芯片時(shí)一次以10～20個(gè)點(diǎn)陣的芯片量為宜，否則點(diǎn)陣過(guò)多在操作不熟練情況下可能導(dǎo)致細(xì)胞芯片編號(hào)混亂而功虧一簣，熟練后方可一次制備更多點(diǎn)陣的芯片。本法不足之處是在將細(xì)胞塊排列在包埋模時(shí)假如操作欠熟練可能有失誤發(fā)生，但我們認(rèn)為在熟練后可以避免此情況發(fā)生的。總之，該簡(jiǎn)易手工制備細(xì)胞塊和細(xì)胞芯片方法是省時(shí)、價(jià)廉、簡(jiǎn)便的檢測(cè)方法，可以得到質(zhì)量穩(wěn)定可靠，便于長(zhǎng)期保存的細(xì)胞塊和細(xì)胞芯片，能滿(mǎn)足臨床和科研需要，特別適用于一般病理科、基層單位或條件簡(jiǎn)陋的實(shí)驗(yàn)室，值得推廣應(yīng)用。

［1］柳瑋華,余小蒙,周小鴿.凝血酶細(xì)胞塊簡(jiǎn)捷制備法［J］臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志,2007,23(6):721-722.

［2］張婉儀,羅麗花,劉惠娟,等.胸腹水細(xì)胞塊制作技術(shù)及應(yīng)用［J］.臨床醫(yī)學(xué)工程,2014,21(1):44-5.

［2］鄭 暉,顏亞暉.介紹一種簡(jiǎn)單適用的胸腹水脫落細(xì)胞石蠟包埋法［J］.中國(guó)組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志,2003,12(4):445-6.

［4］彭先高,羅孟疌.漿膜腔積液脫落細(xì)胞學(xué)檢查方法的改進(jìn)［J］.臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志,26(4):504-5.

［5］吳才良,龍瓊先,劉欣雅,等.免疫組化染色在體液細(xì)胞塊中的作用［J］.成都醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2013,8(3):316-7.

［6］ Ziauddin J,Sabatini DM.Microarrays of cells expressing defined cDNAs［J］.Nature,2001,411(6833):107-110.

［7］ Koh WG,Itle LJ,Pishko MV.Molding of hydrogel microstructures to create multiphenotype cell microarrays［J］.Anal Chem,2003,75(21):5783-9

［8］羅 毅,張露凝,李 軍.一種優(yōu)化的瓊脂糖包埋細(xì)胞微陣列的制備方法［J］.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床,2004,24(6):76-8

［9］翟德忠,柴玲霞,馮萬(wàn)文,等.應(yīng)用組織芯片技術(shù)構(gòu)建細(xì)胞免疫芯片［J］.中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志,2009,19(2):213-4

［10］李文生,郭黨學(xué),王岐山,等.細(xì)胞芯片制備儀的研究及應(yīng)用［J］.西北大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）,2009,39(6):1006-100