結腸電刺激對腸易激大鼠模型內臟高敏感性的影響

， ，

(1.南華大學，湖南 衡陽 421001；2.海南醫學院附屬醫院消化內科；3.海南省人民醫院消化內科)

·基礎醫學·

結腸電刺激對腸易激大鼠模型內臟高敏感性的影響

覃曉日1，譚琰2，孫曉寧3*

(1.南華大學，湖南 衡陽 421001；2.海南醫學院附屬醫院消化內科；3.海南省人民醫院消化內科)

目的探討結腸電刺激對應激誘導產生的內臟高敏感性的影響。方法48只大鼠等分為模型組、對照組，模型組由雙重應激誘導產生，其內臟高敏感性程度由肌電圖及腹部撤退反射的分數來評估,對照組不接受雙重應激。建模后在所有大鼠的結腸漿膜層包埋刺激電極，待手術恢復后分別對各組大鼠進行長脈沖電刺激、短串脈沖電刺激、無電刺激，刺激結束后再次對模型組、對照組大鼠的內臟高敏感性程度進行評估。結果通過應激誘導，模型組大鼠對結腸擴張壓力的敏感性與對照組比較有顯著增加(P<0.01)。串短脈沖、長脈沖結腸電刺激相較無電刺激能夠顯著降低大鼠的內臟高敏感性 (P<0.01)。結論串短脈沖、長脈沖結腸電刺激能夠顯著降低大鼠內臟高敏感性。

結腸電刺激； 腸易激綜合征； 內臟高敏感性； 肌電圖

腸易激綜合征(irritablebowel syndrome,IBS)是一組持續或間歇發作，以腹痛、腹脹、排便習慣或大便性狀改變為臨床表現，而缺乏胃腸道結構和生化異常的功能紊亂性疾病[1]。IBS目前依舊以癥狀學作為臨床診斷和研究，其病理生理學基礎主要是胃腸動力學異常和內臟高敏感性，內臟高敏感是指內臟對正常生理性或傷害性刺激的感覺閾值降低，導致異常的內臟痛覺形成和異常的傳出信號通過迷走通路與腸神經系統的聯系，進而影響腸道運動功能。IBS發病率高、病程長、藥物治療效果有限、影響患者生活質量，已成為全球性的難題。現今，體表穴位電刺激已經被廣泛用于治療各種疼痛病癥和胃腸道疾病，包括腸易激綜合征、功能性消化不良、便秘、腹瀉等[2]。相比之下，結腸電刺激(colonic electrical stimulation,CES)的研究遠遠落后于體表穴位電刺激、神經電刺激、心臟起搏等，在近十年中，一些用來調節大腸蠕動功能的結腸電刺激模式在人體和動物模型中運用[3]，Shafik等[4]研究了9位IBS患者，CES顯著減輕了7人IBS癥狀，但其機制尚不明確。研究CES治療慢性內臟痛仍處于起步階段，很多科學證據是零碎的甚至是矛盾的，因此對CES的療效及其機制的進一步調查是值得的。最近有研究者開發了由雙重應激誘導產生IBS大鼠模型的新方法[5-6],結果顯示該大鼠模型的結腸組織沒有出現明顯的炎癥或損傷，但在結腸擴張壓力(colorectal distention，CRD)下產生的內臟高敏感性程度顯著高于對照組，該模型符合IBS患者的主要特征，可作為研究CES治療效果的對象。本研究的目的是為了調查CES是否對IBS大鼠內臟高敏感性產生影響。

1 材料與方法

1.1動物48只體重195～205 g的雄性SD大鼠(湖南史萊克金達實驗動物有限公司提供)，隨機分為對照組和模型組，然后每組又平分為無電刺激組、長電脈沖刺激組、串短脈沖刺激組，每組8只，所有大鼠在恒定溫度和濕度的環境中自由進食與飲水，實驗前一晚所有大鼠禁食不禁水，海南省藥物安全性評價中心動物護理和使用委員會批準了該手術和實驗方案。

1.2腸易激綜合征大鼠模型的建立

1.2.1 雙重應激誘導 模型組大鼠需要完成為期6天的雙重應激誘導，如文獻[5]中所述包括40 min的束縛應激及20 min的強迫游泳應激。兩種壓力在上午8時～11時實施，束縛應激是將大鼠限制在一個透明的塑料容器內(直徑6 cm×長度18 cm)，容器兩頭都有2 cm直徑的開口便于大鼠正常呼吸。休息1 h后實施強迫游泳應激，室溫下(約22 ℃)將大鼠置于一只裝有水的塑料桶內(高35 cm×直徑24 cm),水面距桶上緣約15 cm。對照組大鼠被帶到實驗室而不施加壓力。

1.2.2 肌電圖(EMG，electromyography)測量 造模結束后，對所有大鼠(包含對照組及模型組)進行肌電圖測量。測量方法為：將帶氣囊尿管(F6.美國巴德公司)涂抹凡士林后經大鼠肛門插入7 cm到達結腸，在尾部距肛門2 cm處固定，一對電極(美國明尼阿波利斯市美敦力公司)被植入在腹外斜肌外面[7]，電極線另一頭與測試設備連接，大鼠置于固定器(20 cm×8 cm×8 cm)(北京合力科創科技發展有限公司)適應30 min。結腸分級擴張壓力是通過注射不同容積的水(1 mL H2O,1.5 mL H2O,2 mL H2O)膨脹導尿管氣囊完成的[8]，擴張持續20 s后休息2 min(防止腸道缺血壞死)。在濾波為500 Hz條件下將肌電信號放大，記錄于BL-420E生物機能試驗系統中(中國成都泰盟科技有限公司)，由計算機程序算出每20 s膨脹壓力下的肌電曲線面積值(AUC)[9]，通過每次膨脹壓力期的值減去前20 s的基線值得到凈值。每只大鼠在3種擴張壓力下各測試兩次，平均值作為該大鼠的肌電評分用于之后的統計分析。

1.2.3 腹部撤離反射分數(abdominal withdrawal reflx scores,AWRs)測量 內臟高敏感性敏程度同樣可以依靠不同結腸壓力下大鼠的行為反應來評估。通過盲法原則觀察大鼠AWR分數，評分標準[10]參考表1，將各大鼠在每種膨脹壓力下的AWR評分測試兩次，取平均值并用于之后的統計分析。另外，執行AWRs及EMG分析的工作人員將不參與分配對照組和模型組、假電刺激組和電刺激治療組等事宜。

表1腹壁撤退反射(AWR)評分標準

1.3手術方法水合氯醛(4 mg/kg)腹腔麻醉大鼠后行腹部正中切口暴露結腸，將一對單相心臟起搏電極(美國明尼阿波利斯市美敦力公司)包埋在距肛門4 cm的降結腸漿膜層[7]，兩支電極相距約1 cm,荷包縫合固定。電極線的另一端循著皮下從大鼠頸后部穿出固定和編號，待動物從手術中恢復后行進一步實驗(通常為術后1周)。

1.4結腸電刺激電刺激由BL-420E生物機電系統提供。長脈沖CES選擇的是頻率20 cpm、脈沖寬度200 ms、振幅10 mA(恒流輸出)的電刺激，短串脈沖CES使用的是通電2 s后斷電3 s的成串刺激，頻率40 Hz，脈沖寬度4 ms，脈沖振幅10 mA。根據已有的動物實驗[11]顯示此參數的結腸電刺激有促進結腸傳輸作用。手術康復后，模型組及對照組大鼠根據刺激方法的差異分別隨機分為3小組(每組8只)：無電刺激、長脈沖CES、短串脈沖CES。完成40 min的電刺激后，再次對模型組大鼠的EMG 和AWR分數進行測定。

2 結 果

2.1聯合應激誘發了內臟高敏感性模型組大鼠完成6天的聯合應激之后測定了EMG 及AWR分數。對照組在1.0、1.5、2.0 mL容積的結腸擴張壓力下的AWR評分分別為1.2±0.4、2.0±0.6和2.5±0.7，結束最后應激時模型組大鼠的AWR評分分別為2.1±0.5、2.9±0.5和3.6±0.5(見圖1A)，統計分析結果表明聯合刺激后大鼠的腹壁撤退反射程度有顯著增加(P<0.01,雙向重復測量方差分析，n=24)。為了進一步證實聯合應激增加了內臟高敏感性，將兩組大鼠的肌電圖同樣進行了對比，對照組在1.0、1.5、2.0 mL球囊容積結腸擴張壓力下的肌電圖曲線下面積值(AUCs)分別為34.7±3.6、43.5±3.0和55.6±3.7，模型組AUC分別為50.1±2.6、65.6±4.4和82.7±5.0(見圖1B、C)，統計分析結果表明聯合刺激后的大鼠肌電圖面積有顯著增加(P<0.01，雙向重復測量方差分析，n=24)，充分證明聯合刺激可誘發內臟高敏感性。

圖1 聯合應激誘發了內臟高敏感性 A:AWR評分;B 、C：AUC

2.2 CES治療抑制了IBS大鼠的內臟高敏感性將HIS大鼠的CES組與假CES組的AWR評分及EMG曲線下面積進行比較，來確定聯合刺激誘發的內臟高敏感性能否被CES所抑制，為了證明CES具有明確的止痛作用，假CES組植入了電極但不提供電刺激，AWR評分和EMG活動在電刺激結束后再次進行評估。結腸擴張壓力、CES兩種因素都顯著影響了AWRS的值(n=8，雙向重復測量方差分析，結腸壓力的效果，P<0.01；CES治療效果，P<0.01)。CES治療顯著降低了模型組大鼠的AWR分數(在1mL球囊容積的結腸擴張壓力下，假CES組、短串脈沖CES組、長脈沖CES組的AWRS值為2.0±0.6、1.4±0.5、1.6±0.5;在1.5mL容積的擴張壓力下為2.7±0.5、2.0±0.8、2.1±0.7;在2 mL容積的擴張壓力下為：3.6±0.5、2.7±0.5、2.9±0.4；CES治療顯著降低了模型組大鼠的AWR評分(P<0.01，雙向重復測量方差分析，圖2A)。為了進一步證實CES對腸易激大鼠產生了效果，將CES組與假CES組的EMG曲線下面積(AUC)進行比較，結腸擴張壓力、CES兩種因素都顯著影響AUC的值(n=8，雙向重復測量方差分析：結腸擴張壓力效果，P<0.001;CES的治療效果，P<0.001)。(圖2B、C)CES組相比假CES組的AUC值顯著降低(假CES組、短串脈沖CES組、長脈沖CES組，在1 mL球囊容積的擴張壓力下的AUC值為51.2±3.3、40.0±2.7、43.6±4.0；在1.5 mL球囊容積的擴張壓力下為62.2±4.4、51.7±4.4、55.9±4.1；在2 mL球囊容積的擴張壓力下為78.7±5.2、64.2±4.8、67.0±4.2)。證明了CES能顯著抑制內臟高敏感性，即在內臟高敏感性大鼠降結腸應用40 min的CES后能顯著減輕由結腸擴張引起的疼痛。

圖2 CES治療抑制了IBS大鼠的內臟高敏感性 A:AWR評分;B、C：AUC

3 討 論

本研究顯示，CES治療能顯著降低結腸擴張下的內臟高敏感性大鼠的AWR分數和EMG活動，明確表明CES對該模型具有鎮痛作用。盡管普通電刺激已經在臨床上常用于緩解各類疼痛[12-13]，但還沒有關于CES治療內臟高敏感性的系統性研究，在本試驗中，兩種電刺激參數的CES都顯著抑制了大鼠的內臟高敏感性，所以未來的工作是需要進一步研究CES產生鎮痛效果的機制，以及尋求更合適的電刺激參數來達到鎮痛效果。

內臟高敏感性由多種神經遞質在外周、脊髓和中樞之間調控，其部分的工作模式包括[14]：結腸高敏感反應的痛覺輸入，腸黏膜通透性增加從而誘導內臟傷害性驅動，胃腸組織的microRNA經由血流、微泡被遞送到其它靶器官而改變外周或中樞神經系統的表達等。臨床上有許多關于體表電刺激止痛機制的研究[15]，內源性阿片類機制可以明確解釋此效應，關于電刺激鎮痛的非阿片類機制也通過實驗被證實，包括5-HT的調節、兒茶酚胺或腎上腺素受體拮抗劑的誘發、細胞單胺含量的消耗等[16]。

從心臟起搏器到結腸電刺激，它基本的原理是利用不同頻率的外部電流來糾正異常電節律，從而達到治療器官功能障礙的效果[3]，結腸蠕動失常導致了腹痛的發生及排便習慣的改變,這是與IBS癥狀相符的，在本研究中，特定刺激位置及參數的選擇就是為了改善腸易激綜合征的癥狀而設定的。根據刺激參數的差異可分為長脈沖電刺激(波寬大于10 ms)，短脈沖電刺激(波寬小于1 ms或5 ms)及串脈沖電刺激(由短串脈沖組成)[17-18]。不同參數的電刺激對胃腸道產生不同的影響，Shafi等[4]研究顯示，以6 mA(波幅)、150 ms(波寬)以及高出結腸波基線水平頻率5%的結腸電刺激治療IBS患者，通過6個月療程7/9的IBS患者癥狀改善；Bertschi等[19]在豬的盲腸給予刺激參數為1 ms、7～15 mA、120 Hz的短脈沖，結果顯示電刺激可以誘導盲腸的收縮和結腸內容物的運動；Sevcencu等[20]表明，幾十毫秒長脈沖可以將肌肉細胞直接去極化，而如果脈沖小于10 ms則通過膽堿能系統的活化誘導肌肉收縮，另一方面電刺激結腸壁產生的效果是結腸肉收縮及舒張的綜合而不是單一的反應；也有研究顯示結腸肌肉的舒張主要通過遞質釋放激活氮能通道所誘導[21]。

本研究表明CES可顯著抑制IBS大鼠的內臟高敏感性,有望成為一項治療腸易激綜合征的新方法。當然目前的研究也存在一定的局限性，大多數的電刺激模式還只是運用在動物模型中，如果要研究出適用于人類的刺激模式，進一步的實驗以及刺激的方法的改進是必要的，這樣才能更好的了解結腸電刺激的機制以及運用于臨床。

[1] Cremonini F,Talley NJ.Irritable bowel syndrome：epidemiology，natural history，health care seeking and emerging risk factors [J].Gastroenterol Clin North Am,2005,34(2):189-204.

[2] Schneider A,Streitberger K,Joos S.Acupuncture treatment in gastrointestinal diseases:a systematic review [J].World J Gastroenterol,2007,13:3417-3424.

[3] Sevcencu C.Electrical stimulation-an evolving concept in the treatment of colonic motor dysfunctions [J].Neurogastroenterol Motil,2006,18:960-970.

[4] Shafik A,EI-Sibai O,Shafik AA,et al.Colonic pacing in the treatment of patients with irritable bowel syndrome:technique and results [J].Front Biosci,2003,8:1-5.

[5] Winston JH,Xu GY,Sarna SK.Adrenergic stimulation mediates visceral hypersensitivity to colorectal distension following heterotypic chronic stress [J].Gastroenterology,2010,138:294-304.

[6] Zhou YY,Wanner NJ,Xiao Y,et al.Electroacupuncture alleviates stress-induced visceral hypersensitivity through an opioid system in rats [J].World J Gastroenterol,2012,18:7201-7211.

[7] Larsson M,Arvidsson S,Ekman C,et al.A model for chronic quantitative studies of colorectal sensitivity using balloon distension in conscious mice-effects ofopioid receptor agonists[J].Neurogastroenterology Motil,2003,15:371-381.

[8] Xu GY,Shenoy M,Winston JH,et al.P2X receptor-mediated visceral hyperalgesia in a rat model of chronic visceral hypersensitivity [J].Gut,2008,57:1230-1237.

[9] Winston J,Shenoy M,Medley D,et al.The vanilloid receptor initiates and maintains colonic hypersensitivity induced by neonatal colon irritation in rats [J].Gastroenterology,2007,132:615-627.

[10] Ma XP,Tan LY,Yang Y,et al.Effect of electro-acupuncture on substance P,its receptor and corticotropin-releasing hormone in rats with irritable bowel syndrome [J].World J Gastroenterol,2009,15:5211-5217.

[11] 李文波,劉詩,錢偉,等.串脈沖和長脈沖結腸電刺激對大鼠結腸傳輸的影響[J].中華醫學雜志,2006,86:3370-3372.

[12] Sun S,Cao H,Han M,et al.Evidence for suppression of electroacupuncture on spinal glial activation and behavioral hypersensitivity in a rat model of monoarthritis [J].Brain Res Bull,2008,75:83-93.

[13] Kim HN,Park JH,Kim SK,et al.Electroacupuncture potentiates the antiallodynic effect of intrathecal neostigmine in a rat model of neuropathic pain[J].J Physiol Sci,2008,58:357-360.

[14] Zhou Q,Verne GN.New insights into visceral hypersensitivity -clinical implications in IBS[J].Nat Rev Gastroenterol Hepatol,2011,8:349-355.

[15] Lin JG,Chen WL.Acupuncture analgesia:a review of its mechanisms of actions [J].Am J Chin Med,2008,36:635-645.

[16] Kim JH,Kim HY,Chung K,et al.Electroacupuncture reduces the evoked responses of the spinal dorsal horn neurons in ankle-sprained rats [J].J Neurophysiol,2011,105:2050-2057.

[17] Sallam HS,Chen JD.Colonic electrical stimulation:potential use for treatment of delayed colonic transit [J].Colorectal Dis,2013,15:244-249.

[18] Vaucher J,Cerantola Y,Gie O,et al.Electrical colonic stimulation reduces mean transit time in a porcine model [J].Neurogastroenterol Motil,2010,22:88-92.

[19] Bertschi M,Schlageter V,Vesin JM,et al.Direct electrical stimulation using a battery-operated device for induction and modulation of colonic contractions in pigs [J].Ann Biomed Eng,2010,38:2398-2405.

[20] Sevcencu C,Rijkhoff NJ,Sinkjaer T.Muscular vs.neural activation in propulsion induced by electrical stimulation in the descending colon of rats [J].Neuromodulation,2005,8:131-140.

[21] Liu S,Chen JD.Colonic electrical stimulation regulates colonic transit via the nitrergic pathway in rats [J].Dig Dis Sci,2006,51:502-505.

EffectofColonicElectricalStimulationonVisceralHypersensitivityinRatswithIrritableBowelSyndrome

QIN Xiaori,TAN Yan,SUN Xiaoning

(UniversityofSouthChina,Hengyang,Hunan421001,China)

ObjectiveTo investigate whether stress-induced visceral hypersensitivity could be alleviated by colonic electrical stimulation (CES).Methods48 male rats were divided into model group and control group,visceral hypersensitivity model was induced by a 6 d heterotypic intermittent stress,the extent of visceral hypersensitivity was quantified by electromyography and abdominal withdrawal reflx scores.After the modeling,all rats were equipped with electrodes in descending colon.After recovering from surgery,CES with long pulses,CES with trains of short pulses,sham CES was performed.Finally,the extent of visceral hypersensitivity will be quantified again in model group.ResultsRats displayed an increased sensitivity to colorectal distention,after a 6 d heterotypic intermittent stress compared to control group at different distention pressures (P<0.01).CES with trains of short pulses and long pulses significantly attenuated the hypersensitive responses to colorectal distention compared with sham CES group (P<0.01).ConclusionCES with long pulses,CES with trains of short pulses all can significantly alleviate stress-induced visceral hypersensitivity.

colonic electrical stimulation； irritable bowel syndrome； visceral hypersensitivity； electromyography

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2015.05.004

2015-06-16；

2015-09-06

海南省重點科技計劃項目(SQ2013ZDXM0385).

*通訊作者，E-mail:xnsun-010 8@163.com.

R574.6

A

(此文編輯：朱雯霞)