Kiss-1高表達抑制結腸癌侵襲與轉移能力的影響

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(1.南華大學附屬第一醫院消化內科，湖南 衡陽 421001；2.南華大學研究生院)

·基礎醫學·

Kiss-1高表達抑制結腸癌侵襲與轉移能力的影響

劉迪群1*，溫彩玲2，鐘華1，周偉偉1

(1.南華大學附屬第一醫院消化內科，湖南 衡陽 421001；2.南華大學研究生院)

目的探討Kiss-1高表達對結腸癌SW480細胞侵襲與轉移能力的影響，初步明確Kiss-1基因對基質金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)和MMP-2表達的影響。方法用脂質體轉染方法將質粒pEGFP-N1-Kiss-1及pEGFP-N1空載體質粒瞬時導入結腸癌SW480細胞，細胞隨機分三組：空白對照組、陰性對照組、實驗組。應用Transwell實驗檢測結腸癌細胞的侵襲能力、Western-blot和Real-time PCR分別從蛋白和mRNA水平檢測Kiss-1表達對MMP-9、MMP-2表達的影響。結果成功將pEGFP-N1-Kiss-1重組質粒瞬時導入結腸癌SW480細胞。Transwell實驗檢測出實驗組較陰性對照組和空白對照組能明顯降低SW480細胞侵襲能力的作用(P<0.05)。Western blot和Real-time PCR檢測出實驗組Kiss-1 蛋白和mRNA表達水平較陰性對照組或空白對照組顯著增加，而實驗組MMP-9、MMP-2蛋白和mRNA表達水平顯著降低，其差異均具有統計學意義(P<0.05)。結論Kiss-1抑制MMP-9和MMP-2的表達，其調控機制可能與抑制結腸癌的侵襲和轉移能力有關。

結腸癌SW480細胞； Kiss-1； MMP-9； MMP-2； 侵襲； 轉移

結腸癌是一種常見的消化道惡性腫瘤，在發達國家結腸癌患者死亡率位居惡性腫瘤第2位[1]。近年我國結腸癌發病率呈逐年上升趨勢，目前結腸癌的主要治療方法是外科手術，但仍有40%～50%的結腸癌患者術后會出現復發和轉移[2]。腫瘤的侵襲和轉移與蛋白酶有關，特別是腫瘤細胞分泌的基質金屬蛋白酶(MMPs)，其中MMP-9和MMP-2尤為重要[3]。Kiss-1基因被確定為人類一種新的轉移抑制基因，通過顯微細胞介導將人類6號染色體轉移到人黑色素瘤細胞株C8161，其Kiss-1表達能顯著抑制在裸鼠中成瘤的轉移能力[4]。因此，本研究旨在體外瞬時轉染Kiss-1高表達的結腸癌SW480細胞，擬探討Kiss-1高表達對結腸癌SW480細胞侵襲與轉移能力的影響，初步明確Kiss-1對MMP-9、MMP-2的表達影響，為結腸癌的發病機制和尋找新的治療策略提供理論依據。

1 材料與方法

1.1主要材料結腸癌SW480細胞保存于南華大學附屬第一醫院臨床研究所-80 ℃冰箱中；質粒pEGFP-N1-Kiss-1及空載體(pEGFP-N1)質粒由上海吉凱公司合成，均含有綠色熒光蛋白(GFP)，經測序鑒定無誤；脂質體轉染試劑盒LipofectamineTM 2000購自美國 Invitrogen 公司；鼠抗人Kiss-1購自Millipore公司(原裝進口)；鼠抗人β-actin購自北京中杉金橋生物公司(國產)，兔抗人MMP-9和MMP-2 購自武漢博士得公司(國產)；總RNA提取試劑盒購自上海生工生物工程公司，RT-PCR 逆轉錄試劑盒和qPCR Master Mix購自BIONEER公司；引物均由上海生工生物公司合成，經DNA質譜檢測無誤。

1.2細胞培養及分組將結腸癌SW480細胞培養于10%新生牛血清的1 640培養基中，置于5%CO2、37 ℃培養箱中培養，當細胞生長達90%以上融合度時將其隨機分為三組：空白對照組：未轉染細胞組；陰性對照組：轉染pEGFP-N1空載體細胞組；實驗組：轉染質粒pEGFP-N1-Kiss-1細胞組。

1.3實驗方法

1.3.1 瞬時轉染 取對數期生長細胞[5]，以3×106個細胞/孔的密度鋪于6孔板培養，當細胞融合度達70%時進行轉染，用無血清1 640培養基將3.2 μg pEGFP-N1-Kiss-1質粒和8 μL Lipofectamine2000分別稀釋至總體積為250 μL，室溫下靜置5 min，按照以上組合制備 lipofectamineTM2000- pEGFP-N1-Kiss-1混合物，在室溫下孵育 20 min后，將混合物加入6孔板細胞中，用無血清1 640培養基定容至2 mL，在 37 ℃、5% CO2培養箱中孵化6 h后更換含10%新生牛血清的1 640培養基終止轉染，轉染48 h后在熒光顯微鏡下觀察細胞，確定轉染效率。陰性對照組轉染方法同實驗組。轉染效率=(發出綠色熒光細胞數/可見光下的總細胞數) ×100%。

1.3.2 Transwell侵襲實驗 將有基質膠的transwell小室(Corning，美國，8.0 μm孔徑)置入無菌的 24 孔培養板中。再取已做好轉染的實驗組、陰性對照組及空白對照組細胞，用胰酶消化細胞，用無血清1 640培養基懸浮、計數，稀釋至密度為 1×106/mL，每個上室中分別加入200 μL細胞懸液，24 孔板每個下室加入 600 μL含有 30%新生牛血清的1 640培養基。置于37 ℃、5% CO2培養箱中繼續培養，待培養48 h后棄去孔中舊培養液，PBS清洗 2 遍，用4%甲醛500 μL/孔加入下室進行固定30 min，用棉簽輕輕擦掉上層未遷移細胞，再用1%結晶紫500 μL染色20 min，用清水洗3遍以上，最后在400倍顯微鏡下隨機觀察五個視野并計每個視野內穿透小室微孔膜的細胞數，計算平均侵襲細胞數和侵襲抑制率。侵襲抑制率(IR)的公式為：IR(%)=(空白對照組穿膜數-實驗組穿膜數)/對照組穿膜細胞數×100%。

1.3.3 Real-time PCR Kiss-1、MMP-9、MMP-2和GADPH引物均由上海生工生物技術有限公司合成，引物序列見表1。按照總RNA提取試劑盒操作步驟提取已做好轉染的實驗組和陰性對照組細胞的總RNA，檢測其吸光度(OD260/OD280)值和濃度；按AccuPower?RocketScriptTM RT MasterMix試劑盒，將總RNA反轉錄生成cDNA，反轉錄條件為：引物退火 37 ℃ 1 min；CDNA合成(反轉錄反應) 42 ℃ 60 min；滅活(反轉錄酶的失活反應) 95 ℃ 5 min；最后將cDNA按2X GreenstarTM qPCR Master Mix試劑盒進行PCR擴增反應，每組設三個復孔，反應程序為：預變性，95 ℃ 5 min；PCR反應，95 ℃ 5 s；60 ℃ 30 s，51個循環。PCR反應結束后采用溶解曲線確定產物特異性，以2-△△CT值表示目的基因的相對表達量，以GADPH作為內參；△△CT =實驗組目的基因的△CT值-陰性對照組目的基因的△CT值，實驗結果均為3次獨立重復實驗。

表1Kiss-1、MMP-9、MMP-2和GADPH的引物序列

名稱引物序列(5'→3')Kiss-1F:CACCCTCTGGACATTCACCR:CAGTAGCTGCCAAGAAACCAMMP-9F:CAGTCCACCCTTGTGCTCTTR:ACTCTCCACGCATCTCTGCMMP-2F:AGTTTCCATTCCGCTTCCAGR:CGGTCGTAGTCCTCAGTGGTGADPHF:AGAAGGCTGGGGCTCATTTGR:AGGGGCCATCCACAGTCTTC

1.3.4 Western-blot 分別提取已做好轉染的空白對照組、陰性對照組及實驗組中SW480細胞總蛋白，采用BCA試劑盒測定各組樣本蛋白濃度，用10%和15%聚丙烯酰胺凝膠電泳，半干轉法轉移至聚偏二氟乙烯膜(poly vinylidene fluoride,PVDF膜)后，用5%封閉液(TBST中含5%脫脂奶)室溫封閉2 h，再依次孵育對應一抗及二抗，最后利用凝膠成像系統(配備有軟件BIO-ID)采集圖像，采用AlphaImager2200凝膠圖像系統對圖片進行灰度值掃描，最后采用GraphPad Prism軟件進行制圖。實驗重復3次,分別檢測Kiss-1、MMP-9和MMP-2蛋白的表達。

1.4統計學分析方法應用SPSS19.0 進行統計分析，計量資料用均數+標準差表示，采用單因素方差分析比較兩組間的差異，P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 pEGFP-N1-Kiss-1質粒轉染至結腸癌SW480細胞的轉染效率pEGFP-N1-Kiss-1質粒轉染48 h后，在熒光顯微鏡下觀察細胞，轉染效率達90%以上(圖1)。

圖1 pEGFP-N1-Kiss-1質粒轉染至SW480細胞48h后綠色熒光蛋白的表達(400×) A：正常；B：熒光

2.2 Transwell檢測Kiss-1對結腸癌SW480細胞侵襲的影響三組結腸癌SW480細胞侵襲實驗結果見表2和圖2。實驗組侵襲細胞數(14.50±3.88)顯著低于陰性對照組(19.22±4.87)及空白對照組(21.12±5.12)SW480細胞侵襲數(P<0.05)。實驗組侵襲抑制率顯著高于陰性對照組(P<0.05)。Kiss-1能明顯降低結腸癌SW480細胞的侵襲能力。

表2Transwell檢測Kiss-1對三組結腸癌SW480細胞侵襲的影響(n=3)

組別細胞侵襲數(個)侵襲抑制率(%)空白對照組21.12±5.120.00陰性對照組19.22±4.877.75±1.18實驗組14.50±3.88ac24.38±6.25a

與陰性對照組比較，a：P<0.05；與空白對照組比較，c：P<0.05

圖2 Transwell檢測Kiss-1對三組結腸癌SW480細胞侵襲的影響 與陰性對照組比較，a：P<0.05；與空白對照組比較，c：P<0.05

2.3 Real-time PCR檢測Kiss-1、 MMP-9和MMP-2在結腸癌SW480細胞中mRNA相對表達量陰性對照組和實驗組細胞Kiss-1、 MMP-9和MMP-2mRNA相對表達量結果如圖3所示。實驗組中Kiss-1mRNA高表達，而MMP-9和MMP-2mRNA的表達水平顯著降低，兩組比較差異均具有統計學意義(P<0.05)。Kiss-1高表達可抑制MMP-9、MMP-2的表達。

2.4 Western-blot檢測Kiss-1、 MMP-9和MMP-2在SW480細胞中蛋白的表達三組SW480細胞中Kiss-1、 MMP-9和MMP-2蛋白的表達結果如圖4所示。結果顯示： Kiss-1蛋白在實驗組中高表達，而在陰性對照組與空白對照組中低表達，三組比較差異具有統計學意義(P<0.05)。MMP-9和MMP-2蛋白在實驗組中表達水平明顯低于陰性對照組(P<0.05)和空白對照組(P<0.05)。Kiss-1高表達可抑制MMP-9、MMP-2的表達。

圖3 Real-time PCR檢測Kiss-1、 MMP-9和MMP-2在結腸癌SW480細胞中mRNA相對表達量 與陰性對照組比較，*：P<0.05

3 討 論

絕大多數中晚期腫瘤患者預后與是否發生遠處轉移呈正相關，轉移是一個多步驟過程并涉及復雜的腫瘤細胞與宿主細胞間的相互作用[6]。當腫瘤發生發展時可激活MMP-9和MMP-2形成IV型膠原、V型膠原和明膠 ，在細胞外基質(extracellular matrix，ECM)的降解和再塑造中發揮重要作用，并可使腫瘤細胞沿著缺失的基底膜向周圍組織產生浸潤，從而引起腫瘤發生侵襲和轉移[3]。因此，越來越多的研究熱點是如何抑制轉移性腫瘤的進展。早有研究發現，在多種已發生轉移的腫瘤中Kiss-1呈低表達，如胃癌、乳腺癌、鼻咽癌[5，7-8]，這表明Kiss-1作為轉移抑制基因及其受體的缺失可能與人類腫瘤的進展和轉移密切相關。目前Kiss-1基因的抑制機制至今尚未清楚。早有報道說Kiss-1基因抑制轉移的機制可能與細胞外調控ERK磷酸化及誘導胞質IkBα降解胞漿中p65/p60含量，進而使MMP-2和MMP-9表達減少有關[9-10]。而最近Ji等[11]在大腸癌中研究發現Kiss-1通過抑制ERK磷酸化途徑而不是JNK途徑，最終促使NF-kB降解使MMP-9活性下降，這將對于抑制腫瘤轉移具有重大作用。除此之外，實驗數據報道Kiss-1可明顯抑制大腸癌HT115細胞系的侵襲和遷移能力，并且臨床隊列研究的初步數據也支持這一論點。同時也不乏學者研究大腸癌組織中發現Kiss-1甲基化和蛋白表達對于診斷和判斷預后有重要意義[11]。本次研究發現Kiss-1可顯著降低結腸癌SW480細胞的侵襲能力，關鍵是實驗數據表明Kiss-1與MMP-9、MMP-2在蛋白和mRNA表達水平均呈顯著負相關，這與以往研究的相關結論一致。因此筆者考慮：在結腸癌發病過程中，Kiss-1促使MMP-9和MMP-2基因發生紊亂、酶原產生增加、降解腫瘤細胞基膜的IV型膠原、層黏連蛋白等成分和破壞基底膜的完整性，最終促進腫瘤的發展。由此推測Kiss-1抑制MMP-9和MMP-2的表達，其調控機制可能與抑制結腸癌的侵襲和轉移能力有關。

圖4 Western-blot檢測Kiss-1、 MMP-9和MMP-2在3組結腸癌SW480細胞蛋白的表達 1：空白對照組；2：陰性對照組；3：實驗組 與空白對照組比較,a：P<0.05；與陰性對照組比較，c：P<0.05

綜上所述,Kiss-1 基因的高表達與抑制結腸癌的侵襲和轉移能力的形成密切相關，可能通過抑制MMP-9和MMP-2的表達而抑制結腸癌的侵襲和轉移能力的形成。因此，深入研究 Kiss-1 基因表達的調控機制及抑制腫瘤轉移的機制將為結腸癌患者的治療開辟一條新的途徑。

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TheEffectofKiss-1HighExpressionOnInhibitingInvasionandMetastasisofColonCancer

LIU Diqun，WEN Cailing，ZHONG Hua，et al

(DepartmentofGastroenterology，theFirstAffiliatedHospital，UniversityofSouthChina，Hengyang,Hunan421001，China)

ObjectiveTo explore the effect of Kiss-1 high expression on invasion and metastasis of the colon cancer SW480 cells.To preliminarily define the influence of kiss-1 genes to the expressions of matrix metalloproteinase-9(MMP-9) and MMP-2.MethodsTo guide plasmids pEGFP-N1-Kiss-1 and pEGFP-N1 into the colon cancer SW480 sells instantly with the method of lipofectin transfection.Divide cells into three groups:the blank control group with no transfection cell,the negative group with transfection of the empty pEGFP-N1 cell,the experimental group with transfection of plasmid pEGFP-N1-Kiss-1 cell and up-regulation Kiss-1 expression level in colon cancer cells.Applicate Transwell experiment to detect the invasion ability of the colon cancer cells.Western blot and Real-time PCR,respectively from protein and the level of mRNA,were used to detect the influence of Kiss-1 expression to the expressions of MMP-9 and MMP-2.ResultsSuccessfully guided pEGFP-N1-Kiss-1 recombinant plasmid into the colon cancer SW480 sells.Transwell experiments detected that the experimental group,compared with the negative control group and the blank control group,can obviously reduce SW480 cells invasion ability (P<0.05).Western blot and Real-time PCR detected that the experimental group Kiss-1 protein and mRNA expression level increased significantly,while MMP-9,MMP-2 protein and mRNA expression level decreased significantly,compared with negative control group or blank control group,the differences were statistically significant (P<0.05).ConclusionKiss-1 can inhibit the expressions of MMP-9 and MMP-2.Its regulatory mechanism may be related to its inhibition to the invasion and metastasis ability of colon cancer.

SW480 colon cancer cells; Kiss-1; MMP-9; MMP-2; invasion; metastasis

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2015.05.007

2015-05-11；

2015-07-29

湖南省教育廳一般項目(11C1107).

*通訊作者，E-mail：lixiaoyush@163.com.

R735.35

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(此文編輯：蔣湘蓮)