腸炎沙門氏菌活菌標準物質的研制

柯璐，林杰，戴曉麗，黃嫦嬌，黃曉蓉，*

（1.福建出入境檢驗檢疫局技術中心，福建福州350003；2.福建省檢驗檢疫技術研究重點實驗室，福建福州350003）

腸炎沙門氏菌活菌標準物質的研制

柯璐1，2，林杰1，2，戴曉麗1，2，黃嫦嬌1，2，黃曉蓉1，2，*

（1.福建出入境檢驗檢疫局技術中心，福建福州350003；2.福建省檢驗檢疫技術研究重點實驗室，福建福州350003）

本文以腸炎沙門氏菌為選制菌種，用雞肉糜混合保護劑配方作為活菌標準物質基質，采用冷凍真空干燥法研制活菌標準物質，共進行了3個批次的研究，每個批次分別制備100份熟制基質和100份生制基質的活菌標準物質。均勻性試驗結果表明，生制基質和熟制基質的相對重復性標準差為2.185%和3.596%、相對再現性標準差為2.185%和3.514%，方差分析：P值均大于0.05，表明批次內以及批次間無顯著差異。穩定性試驗表明，在-20℃條件下，2種活菌標準物質穩定性良好。制備的腸炎沙門氏菌活菌標準物質具有相應的菌種特性，良好的穩定性，對研究同類型標準物質具有一定的參考價值，填補實驗室檢測質量控制對照物以及標準物質的空缺。

腸炎沙門氏菌；標準物質；雞肉基質

腸炎沙門氏菌（Salmonella enteritidis，SE）是引起食物中毒的常見致病菌，是公共衛生必須重視的問題。SE在畜禽以及人的體內分離率較高，主要以蛋雞、肉雞和水禽為腸炎沙門氏菌的易感群體，主要引起畜禽和人類的胃腸炎。由SE引起食物中毒的病例頻頻出現，世界衛生組織（世衛組織）在對人類沙門氏菌病監測數據中表明腸炎沙門氏菌的隔離率在增加，嚴重的影響了禽類養殖業的發展，同時也威脅著人類的健康，是公共衛生必須重視的問題，為了能夠有效的預防腸炎沙門氏菌病，必須加緊加快提高目前的檢測技術、加強檢測人員的操作能力以及規范檢測管理體系[1]。食品安全與營養應用中心（CFSAN）的2013-2014年工作要點中規劃了關于降低食源性疾病患病率的目標，文件中制定的工作項目包括了進一步研究腸炎沙門氏菌快速檢測及驗證方法[2]。標準物質（Reference Material，RM）指的是具有一種或多種足夠均勻和很好確定了的特性值，用以校準測量裝置、評價測量方法或給材料賦值的一種材料或物質。標準物質可用于產品質量的監控；在計量學中被用于溯源和復現；用于校準儀器或者作為實際樣品測量工作的標準；在產品標準的驗證與實施方面也起著重要的作用，保證測量結果的可靠性。通過使用標準物質能夠不斷提高實驗室的測試水平和科研能力，是各種檢測技術高效、準確運行的重要前提和保障。菌種標準物質是生物特性標準物質中較為特殊的一類，微生物的生長及其特性的保持都與標準物質的制備條件和保存方法緊密相關，因此，為更好地符合微生物檢測實際狀況，在研究制備微生物標準物質中，國外權威機構已經采用含食品基質的微生物測試樣品[3-5]。然而，目前無論國內外對食品安全檢測領域中的標準物質研究甚少，對于微生物標準物質的研究制備還是處于起步階段，因此建立微生物標準物質的制備方法相當重要。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌源及基質來源

腸炎沙門氏菌Salmonella enteritidis（ATCC13076）菌種購自上海漢尼公司。

雞肉購自福建圣農集團，取雞胸脯肉，低溫運輸。使用前存儲于-20℃。

1.1.2 主要儀器

KD-2100TBC電子天平：福建科迪技術有限公司；MODULYO-4K冷凍干燥機：美國edword公司；Stomacher3500拍擊式均質器：英國SEWARD；Vitek2COM PACT30微生物鑒定儀：生物梅里埃公司；Infinte f200多功能酶標儀：Tecan；SHKE4450臺式恒溫振蕩器：美國Thermo；SC-300A真空包裝機：安溪三和茶葉機械廠；VXE380超低溫冰箱：JOUAN/德國。

1.1.3 主要試劑與材料

緩沖蛋白胨（BPW）；蔗糖（Sucrose）；聚乙烯吡咯烷酮（PVP）；L-谷氨酸鈉-水（Monosodium-L）；脫脂牛奶（Milk）；沙門顯色培養基（法國CHROMagar公司）；菌落計數瓊脂（PCA）耐高溫PP塑料瓶（規格：50m L）。

1.2 SE活菌標準物質制備方法

1.2.1 生長曲線及濃度標準曲線的繪制

SE菌種凍干管用無菌生理鹽水復溶后劃線于沙門顯色平板，（36±1）℃培養18 h～24 h，挑取一環單菌落于5mL無菌生理鹽水中，渦旋混勻后吸取100μL于盛有100mL BPW增菌液中（相當于0.1%的接種量），（36±1）℃培養24 h。取培養到不同時間段的菌液利用多功能酶標儀測定 OD600值，同時按照 GB 4789.2-2010進行菌落計數[6]。

1.2.2 雞肉的前處理

1.2.2.1 制備雞肉糜

用清水擦拭攪拌器攪拌部分，并將各部件暴露于紫外燈下照射30min，使用前再用75%酒精棉球擦拭。將雞肉切成小塊，用剪刀將雞肉中的脂肪組織剪除，分批次攪碎。100g/袋分裝于5#自封袋，-20℃短期保存。

經處理的雞肉糜，按照SN/T 1750-2006及SN/T 2127-2008進行抗生素四大類及氨芐青霉素、羥氨芐青霉素殘留檢測，判定結果均為陰性[7]。

1.2.2.2 雞肉基質滅菌

熟制基質選擇高壓蒸汽滅菌（121℃，滅菌15min）；生制基質選擇鈷-60滅菌（雞肉糜的菌落數級為10-4，鈷-60輻射劑量選擇6KGY）[8]。對滅菌后基質按照GB 4789.2-2010步驟進行菌落總數的測定，基質均達到試驗基質無菌的要求。

1.2.2.3 滅菌后的雞肉糜對SE生長的影響

吸取適當稀釋度的SE菌液100μL于沙門顯色平板上，用無菌涂抹棒涂抹均勻，用無菌鑷子夾取粒狀雞肉糜，間隔放置涂抹菌液平板上，（36±1）℃培養24 h后，觀察雞肉糜周圍菌的生長正常。因此本批次雞肉對SE的生長無影響。

1.2.2.4 雞肉脫水性試驗

2種肉糜分別于50mL耐高溫PP塑料瓶，25 g/瓶，瓶螺口蓋松旋，于-70℃冰箱預凍8 h，放入冷凍干燥機中按照規定程序抽真空[9]。脫水結果如下：

生雞肉凍干后約為7.00 g，脫水率（%）=72.00%，

熟雞肉凍干后約為7.18 g，脫水率（%）=71.27%。

因此凍干標準物質在加水復原時，生雞肉的脫水率及熟雞肉脫水率需加無菌水約18mL。

1.2.3 菌種初始添加濃度的估算與確定

1.2.3.1 標準物質的制備流程

以生制基質為例，選用凍干保護劑配方：20%脫脂奶+10%蔗糖+8%聚乙烯吡咯烷酮+3%谷氨酸鈉-水。保護率為38%。取新鮮培養菌液，根據菌濃度曲線公式，計算菌濃度（記為C1），作適當稀釋后（菌濃度記為C2）與pH=7.0的保護劑配方混合（體積V1∶V2=1∶40），制成混合液（菌濃度記為C3）。稱取基質25 g于無菌PP瓶，加入6mL混合液，輕輕旋上瓶蓋，于-70℃預凍7 h后于冷凍干燥機上凍干。凍干后旋緊瓶蓋，裝入鋁箔袋中，在真空封口機上封口，于-20℃保存。

1.2.3.2 菌種添加濃度的估算

以生制基質為例，設定凍干后樣品菌濃度范圍為100CFU/g～300CFU/g，其含菌數范圍記為S1（700CFU～2 100CFU），因保護率=38%，則凍干前樣品含菌數記為S2，約為1 842CFU～5 526CFU，即C3范圍為3.1× 102CFU/mL～9.2×102CFU/mL。則C2=C3（V1+V2）/V1，由V1∶V2=1∶40得C2=41*C3，則C2范圍為1.3×104CFU/mL～3.8×104CFU/m L。即新鮮培養菌液作適當稀釋后使菌液濃度范圍達到1.3×104CFU/mL～3.8×104CFU/mL。

1.2.3.3 菌種添加濃度的確定

按照2.4.1流程進行制備，將凍干前混合物洗入270mL的pH=7.2無菌磷酸鹽緩沖液（PBS），充分搖勻，按GB 4789.2-2010進行菌落計數。

1.2.4 凍干樣品定值的方法

凍干樣品定值結果=凍干樣品計數值±不確定度。

1.2.4.1 凍干樣品計數方法

以生制基質為例，吸取18mL無菌生理鹽水對凍干物進行復水，將溶解物全部倒入無菌帶濾膜均質袋中，再吸取25m L無菌磷酸鹽緩沖液與之混合，拍擊均質1min，用移液管吸取500μL于沙門氏菌顯色培養基（平行3次），涂布平板，室溫靜置5min，（36±1）℃倒置培養18 h～24 h，計數典型菌落。

1.2.4.2 不確定度評估方法

不確定度包括菌落計數方法不確定度，標準物質定值的不確定度，電子天平的不確定度[10]。

1.2.5 標準物質的批量制備

按照1.2.4.1進行批量樣品制備，將制備好的樣品裝入鋁箔袋中，在真空封口機上封口，于-20℃保存。

2 結果與分析

2.1 生長曲線及濃度標準曲線

2.1.1 生長曲線

以培養時間為橫坐標，以對應的OD600值為縱坐標繪制菌種生長曲線，如圖1。

圖1 細菌生長曲線Fig.1 Thegrow th curve ofbacteria

由圖1可知，培養時間在10 h～19 h期間為菌株生長的對數期階段，該階段細菌代謝旺盛，成幾何級數生長，已完全適應生長環境。因此，用于制備標準物質的添加菌液應選擇該時間段。

2.1.2 濃度標準曲線

取時間為10 h～19 h，以該時間段內OD600為橫坐標，其對應的菌落數常數對數值為縱坐標繪制濃度標準曲線。

圖2 細菌濃度標準曲線Fig.2 The concentration standard curveof bacteria

菌濃度標準曲線方程為：

式中：Y為菌濃度的對數值；X為菌液OD600值。

2.2 標準物質樣品的定值

2.2.1 標準物質樣品的菌落計數

隨機抽取10份樣品，按照2.4凍干樣品的定值方法進行定值，其結果如表1所示。

表1 凍干樣品計數結果（CFU/g）Table1 The count resultof freeze-dried samp le

2.2.2 標準物質樣品的不確定度評估

2.2.2.1 菌落計數方法不確定度的評估結果

各取不同基質的10份樣品進行檢測（平行檢測2次），計算其殘差平方（SS），根據貝塞爾計算公式，計算出檢測結果對數值標準偏差合并樣本的標準差，以評估計數方法給標準物質帶來的不確定度。

生制基質和熟制基質的擴展不確定度分別為：U生=0.018 381、U熟=0.036 47

因此，當計數結果以兩次計數對數值的算數平均值表示時，生制和熟制基質的計數值區間分布于±0.018 381、±0.036 47之間，在本標準定值中可忽略不計。

2.2.2.2 標準物質定值的不確定度評估結果

分別取不同基質的凍干標準物質10份進行檢測。生制和熟制基質標準物質定值方法的擴展不確定度分別為：U生=11、U熟=8。因此當含熟雞肉基質的標準物質測量檢驗結果用3次測量值平均值表示結果時，其值分布區間至±8之間。即在檢測結果表示時應剔除標準物質定值方法不確定度的影響，例如檢測的菌量為X時，則實際值應表示為X±11（X±8）。

2.2.2.3 電子天平的不確定度評估結果

參考測量依據：JJG99-2006《砝碼檢定規程》；JJG1036-2008《電子天平檢定規程》；JJF1059-1999《測量不確定度評定與表示》。

試驗過程中所用電子天平 Satorius/德國的BS200S-WEI，最大量程為310 g，測量分度d=1mg，檢定分度e=10mg，線性誤差△i=2mg，四角誤差△c= 1mg。本次試驗所用的是加載最大標準砝碼值為100 g的F1等級砝碼裝置進行檢測。

經計算置信水平為95%時由JJG 1059-1999附錄A得包含因子k=1.96。

擴展不確定度：U=k×u=1.96×1.425 18=2.793 4mg。因此本試驗用的電子天平的擴展不確定度為U= 2.793 4mg，在本標準物質定值中可忽略不計[11]。

因此，本批次定值結果生制基質和熟制基質分別為：（145±19）±11CFU/g和（139±16）±8CFU/g。

2.3 標準物質的均勻性

共進行了6個批次的成品制備，每批次制備兩類基質各100份。各抽取15份，進行計數。結果如下：

從表2統計分析結果可知，生雞肉和熟雞肉批次重復性標準差分別為2.185%和3.596%，再現性標準差分別為2.080%和3.514%，表明本法具有較好的重復性和再現性。

表2 重復性和再現性Table2 Repeatability standard deviation and Reproducibility standard deviation

表3 方差分析Table3 The Analysisof Variance

由表3說明2類基質批次間和批次內的含量差異不顯著，這表明所研制的標準物質中SE的含量是均勻的[11]。

2.4 標準物質的穩定性

從2種不同添加基質的標準物質中定期任取3袋份，按定值方法測定菌數。根據菌數隨時間的變化來分析標準物質的穩定性。

以時間為橫坐標以標準物質的菌數為縱坐標繪制曲線如下。

從上述曲線來看2種基質的標準物質在第1周內菌數大幅度下降，很不穩定。而之后生肉基質在190天時可以穩定在800CFU/份，而熟雞肉基質穩定性曲線上出現小幅度的波動，其穩定性有待繼續考察。

圖3 生制基質穩定性Fig.3 Stability of Raw chickenm atrix

圖4 熟制基質穩定性Fig.4 Stability ofRooked chickenmatrix

3 結論

本試驗展開對腸炎沙門氏菌標準物質及其核酸標準物質制備技術的研究，期望研制的標準物質能夠發揮包括鑒定、評價、分析、安全監控等用途，為生物特性標準物質的研制提供參考價值。本試驗在生物活性標準物質研制的基礎上添加基質，建立起一套含有雞肉基質的腸炎沙門氏菌標準物質的制備技術。均勻性試驗結果表明，生制基質和熟制基質的相對重復性標準差為2.185%和3.596%、相對再現性標準差為2.185%和3.514%，方差分析：P值均大于0.05，表明批次內以及批次間無顯著差異。穩定性試驗表明，在-20℃條件下，2種活菌標準物質穩定性良好。本試驗基質分為生制、熟制兩種類型，對兩種不同物理狀態下的基質采取相同的制備工藝，其一更好地符合微生物檢測的實際狀況，其二試探性觀察生制與熟制雞肉作為基質對菌種標準物質的影響。

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The Reference M aterials of Preparation about Salmonella Enteritidis

KE Lu1，2，LIN Jie1，2，DAIXiao-li1，2，HUANGChang-jiao1，2，HUANGXiao-rong1，2，*
（1.Fujian Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Fuzhou 350003，Fujian，China；2.Fujian Provincial Key Laboratory of Inspection and Quarantine Technology Research，Fuzhou 350003，Fujian，China）

Choose Salmonella enteritidis to the target species，take Chickenmincemixed protectant formula as matrix in Living Bacterium Reference Material，adopt Lyophilization method to develop Living Bacterium ReferenceMaterial，for the study of three batches total，each batch prepared the RM containing 100 bottlesof Cooked Chicken Matrix and 100 bottlesof Raw Chicken Matrix.The resultsof the uniformity experiment showed that，the repeatability standard deviationofraw chickenmatrixand cooked chickenmatrix is2.185%and 3.596%，the reproducibility standard deviation is2.185%and 3.514%，the resultsof the Analysis of Variance are P＞0.05，it indicated that therewasno significant difference between the six batchesof RM.Stability experiments showed that the RM stord at-20℃，the two kind of RM have good Stability.Conclusion：The Salmonella Enteritidis Living Bacterium Reference Materialwith corresponding strain properties，good stability，and them have great reference value to study the same type ReferenceMaterial，and fill the laboratory testing of quality controlcontrastand Reference Materials.

Salmonella enteritidis；referencematerials；chickenmatrix

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.05.027

2013-11-13

福建省科技廳重點項目（2011Y01010219）

柯璐（1987—），女（漢），助理工程師，碩士，主要從事食品生物學檢測與研究。

*通信作者：黃曉蓉（1958—），女，研究員，主要從事食品生物學檢測與研究。