放線菌G2的鑒定及抗結核桿菌活性研究

李 鏘，張 健，王倫興，王召賀，楊再昌，2*

(1.貴州大學貴州省發酵工程與生物制藥重點實驗室，貴州貴陽550025;2.貴州大學藥學院，貴州貴陽550025)

結核是由結核桿菌引起的傳染病，全世界范圍內每年約有300萬人死于結核。同時，艾滋病患者免疫功能下降，更易感染結核桿菌［1-2］。目前，世界上約1/3的人口已感染了結核桿菌［3-4］，約5千萬人感染耐藥結核桿菌［5-6］。結核桿菌耐藥后，現有抗結核藥物很難殺死耐藥菌株。因此，尋找新型抗結核桿菌活性物質具有重大意義。

最早的抗結核藥物鏈霉素來自于放線菌，經過幾十年的篩選挖掘，似乎已很難從普通土壤中發現新的抗菌素生產菌。國內外近年來在抗結核藥物研發方面主要走化學合成的路子，但是成效并不明顯。

放線菌是一類具有重要經濟價值和多種用途的微生物。目前從微生物中發現的8 000多種微生物活性物質中，有近70%是放線菌產生的［7］。但是，目前人們分離到的放線菌僅占土壤中所有放線菌的10%左右［8］。自然界豐富的放線菌資源仍具有發現新型抗結核藥物的潛力。貴陽市花溪區屬于喀斯特地貌，其淡水資源豐富，從該區域的淡水底層土壤中分離到24株放線菌，其中的G2株具有抗結核桿菌活性。筆者報道了該菌株的分離、鑒定和抗結核活性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株。供試G2菌株分離自貴陽市花溪區地表淡水底層土壤。

1.1.2 培養基。高氏1號培養基［9］;浙江省結核病防治所改良羅氏培養基。

1.2 放線菌分離 采用稀釋平板涂抹法［10］分離。將所取土壤樣本用無菌水稀釋，使用加入苯酚溶液(抑制細菌和真菌的生長)的高氏一號培養基(每100 ml高氏一號培養基中加入2滴濃度10%的苯酚溶液)來分離樣本中的放線菌。28℃恒溫培養7 d，劃線分離直至純化。

1.3 放線菌鑒定

1.3.1 生理生化特征。參照文獻［11］的方法進行。

1.3.2 16S rRNA基因序列分析。將斜面保藏的菌種活化，接種到高氏一號液體培養基［12］，接種后放置搖床中培養。搖床轉速為200 r/min，28℃恒溫培養7 d。用試劑盒提取細菌基因組DNA。擴增采用的引物正向為5＇-CAGAGTTTGATCCTGGCT＇3＇(7F)，反向為 5＇-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3＇(1540R)。PCR 采用 20～50 ng/μl反應體系，在94 ℃預變性4 min，進入循環擴增階段，98℃變性25 s，55℃復性25 s，72℃延伸1 min，循環30次，最后在72℃修復延伸10 min，4℃終止反應。在反應結束后，PCR產物經濃度1%瓊脂糖凝膠電泳檢測、回收，并且進行序列測定。所測序列用Blast軟件與Genebank數據庫中已登錄的16S rRNA序列進行比對，并且用MEGA6軟件進行系統進化樹的構建，從而確定G2菌株的同源性。

1.4 抗結核活性測定

1.4.1 培養基。改良羅氏培養基。

1.4.2 培養液萃取。將高氏1號液體培養基中放線菌G2培養液過濾，得到濾液。先用等體積石油醚萃取，回收石油醚得石油醚萃取物;再用等體積乙酸乙酯萃取，得乙酸乙酯萃取物;剩余物蒸干。

1.4.3 含藥培養基制備。用二甲基亞砜(DMSO)將上述萃取物和剩余物配成10 mg/ml母液，然后將母液與改良羅氏培養基混合，得到含不同樣本濃度的含藥培養基。每個樣本平行作3次，以DMSO作溶劑對照，以異煙肼作陽性作藥物對照。

1.4.4 培養與觀察。將結核桿菌(H37Rv)懸液(1×107cfu/ml)10 μl接種在斜面含藥培養基表面，于37℃培養箱中培養14 d，菌落數小于5個的最小濃度定為樣本抑制結核桿菌的MIC值。

2 結果與分析

在高氏1號培養基中，28℃劃線培養7 d后，菌落呈白色，不透明，最初表面相當光滑，然后發育一層短菌絲體，可能呈顆粒狀、絨狀或毛狀，干燥，不易挑起(圖1A)。革蘭氏染色呈紫色(圖1B)，為革蘭氏陽性菌。菌株G2的主要生理生化特征與白淺灰鏈霉菌基本保持一致。

凝膠電泳分析結果(圖2)顯示，擴增的DNA片段S1911在約1 500 bp(base pair)處有一條明亮的PCR特征性條帶，用Applied Biosystems 3730XL測序軟件得出該菌株的DNA序列為CTGGCTCAGG-GGACGAAGTC，長度為1 461 bp。

將所測序列與NCBI上已登錄的同屬16S rRNA序列進行比對。由圖3可知，G2菌株與登錄號為DQ491194的菌株Streptomyces albogriseolus;B191(白淺灰鏈霉菌)的同源性最高，達到97%。

根據G2菌株的菌落、細菌形態和生理生化特性，結合16s rRNA進行序列比對結果，將G2菌株鑒定為白淺灰鏈霉菌。

G2菌株培養液經分段萃取后，得到石油醚、乙酸乙酯萃取物和萃取后的剩余物。從表1可以看出，G2菌株培養液的乙酸乙酯萃取物和萃取后剩余物具有抗結核桿菌的活性，乙酸乙酯萃取物和剩余物的MIC值分別為為400和800 μg/ml，石油醚萃取物無活性，可見其活性成分應為具有一定極性的小分子化合物。

表1 G2菌株培養液抗結核桿菌活性

3 討論

全世界每年約有140萬人死于結核病，尤其是耐藥結核桿菌感染，對人類健康構成重大威脅。因此，研發新的抗結核藥物任務艱巨。G2菌株屬白淺灰鏈霉菌。許多白淺灰鏈霉菌能產生一種或多種抗細菌、抗真菌、抗藻類、抗病毒、抗原生動物或抗腫瘤的抗菌素。有報道指出，白淺灰鏈霉菌發酵物乙酸乙酯提取物具有較強的抗腫瘤活性［13］。李曉玲［14］研究表明，紅樹植物來源的白淺灰鏈霉菌MGR072蘊藏著豐富的生物堿類次生代謝產物，是尋找藥物先導化合物的重要資源。但迄今為止，有關淺灰白鏈霉菌次生代謝產物抗結核桿菌方面的研究不多。結果表明，G2培養液的乙酸乙酯萃取物具有抗結核桿菌活性，G2菌株分離自淡水底層土壤。這一發現提示具特殊地貌的土壤放線菌具有進一步挖掘新型抗結核藥物的潛力。G2菌株發酵液的乙酸乙酯萃取物成分極其復雜，其抗結核桿菌的活性弱可能與有效成分含量不高有關。雖然萃取后剩余物也顯示出抗結核桿菌活性，很有可能是萃取不徹底造成的，當然并不排除剩余物存在不同于乙酸乙酯萃取物的活性成分。筆者擬對G2菌株的乙酸乙酯萃取物進行活性跟蹤分離，得到活性單體，并且進行結構鑒定和作用機制探討，相關工作正在進行中。

［1］MARíA DEL RAYO CAMACHO-CORONA，MóNICA A.RAMíREZ-CABRERA，OMAR GONZáLEZ-SANTIAGO，et al.Activity against drug resistant-tuberculosis strains of plants used in mexican traditional medicine to treat tuberculosis and other respiratory diseases［J］.Phyother Res，2008，22:82-85.

［2］ELOUARTI A，HAOUAT A C，SQALLI H，et al.Extra-and intracellular antimycobacterial activity of Arbutus unedo L［J］.Afr J Microbiol Res，2012，6:1283-1290.

［3］DYE C.Global epidemiology of tuberculosis［J］.Lancet，2006，367:938-940.

［4］WHO:Global Tuberculosis Control:Epidemiology，Strategy and Financing.Geneva，Switzerland:WHO/HTM/TB/2009.411［R］.2009.

［5］WHO:Global Tuberculosis Control-Surveillance，Planning and Financing.Geneva，Switzerland:WHO/HTM/TB/2007.376［R］.2007.

［6］WHO.耐藥結核病臨床醫生使用指南［S］.2版.北京:中國疾病預防控制中心結核病防治中心，2010.

［7］姜成林，徐麗華.放線菌資源的開發利用［J］.工業微生物，1989，19(6):31-35.

［8］張紀忠，黃靜娟，盛宗斗，等.微生物分類學［M］.上海:復旦大學出版社，1985:214-218.

［9］程麗娟，薛泉宏，來航線，等.微生物學實驗技術［M］.西安:世界圖書出版公司，1988.

［10］楊宇容，徐麗華，李啟任，等.低溫環境中放線菌的研究［J］.云南大學學報:自然科學版，1997(4):397-402.

［11］阮繼生，黃英.放線菌快速鑒定與系統分類［M］.北京:科學出版社，2011:116-152

［12］ZUO Y X，LI L，ZHANG T，et al.Contribution of Streptomyces in sediment to earthy odor in the overlying water in Xionghe reservoir，China［J］.Water Research，2010，44(20):6085-6094.

［13］古靜燕.海洋白淺灰鏈霉菌Streptomyces Albogriseolus A2002抗腫瘤活性成分的研究［D］.青島:中國海洋大學，2004.

［14］李曉玲.紅樹林來源白淺灰鏈霉菌MGR072次級代謝產物的研究和核糖體工程優化［D］.北京:國家海洋局第三海洋研究所，2011.