生殖支原體脂質相關膜蛋白通過c-Src/ROS/Nrf2途徑誘導胎盤滋養層細胞表達血紅素氧合酶

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(1.南華大學附屬第一醫院婦產科，湖南 衡陽 421001；2.南華大學醫學院病原生物學研究所，特殊病原體防控湖南省重點實驗室;3.南華大學心血管疾病研究所)

·基礎醫學·

生殖支原體脂質相關膜蛋白通過c-Src/ROS/Nrf2途徑誘導胎盤滋養層細胞表達血紅素氧合酶

何璐1,2，游曉星2，李國華3，曾焱華2，李冉輝2，朱翠明2，余敏君2，陳忠東1*，吳移謀2

(1.南華大學附屬第一醫院婦產科，湖南 衡陽 421001；2.南華大學醫學院病原生物學研究所，特殊病原體防控湖南省重點實驗室;3.南華大學心血管疾病研究所)

目的探討生殖支原體脂質相關膜蛋白(LAMPs)誘導胎盤滋養層細胞表達血紅素氧合酶-1(HO-1)的分子機制。方法用0.5～5 μg/mL生殖支原體LAMPs處理體外培養的胎盤滋養層細胞4～12 h，采用實時定量PCR和Western blot法分別檢測HO-1 mRNA和蛋白的表達以及核因子相關因子-2(Nrf2)的核轉位；比色法觀察HO-1的酶活性；2′,7′-二氯二氫熒光黃二乙酸酯(H2DCFDA)檢測活性氧產生。分別采用酪氨酸激酶c-Src抑制劑PP1、活性氧抑制劑N-乙酰半胱氨酸(NAC)和Nrf2 siRNA干預，觀察HO-1的表達情況。結果生殖支原體LAMPs能誘導滋養層細胞HO-1 mRNA和蛋白的表達，上調其酶活性。同時，LAMPs也能誘導其產生活性氧，并促使Nrf2核轉位。PP1和NAC預處理后，可明顯降低HO-1的表達水平以及細胞核內Nrf2含量。采用Nrf2 siRNA轉染后，HO-1的表達顯著減少。結論生殖支原體LAMPs通過c-Src/ROS/Nrf2途徑誘導滋養層細胞表達HO-1。

生殖支原體； 脂質相關膜蛋白； 血紅素氧合酶-1； 滋養層細胞

生殖支原體(Mycoplasma genitalium)是Tully等人從男性非淋球菌尿道炎患者體內分離出來的一種病原體。它作為一種病原微生物的觀點已被人們接受。生殖支原體黏附至生殖道黏膜后，主要通過其細胞膜中的脂質相關膜蛋白(lipid-associated membrane proteins，LAMPs)發揮致炎作用，從而引起女性多種泌尿生殖系統疾病如盆腔炎、宮頸炎、不育(孕)癥，并參與胎膜早破、產褥感染和新生兒肺炎等不良妊娠的發生[1]。胎盤滋養層細胞是母體和胎兒進行物質交換的場所，同時也是母體固有免疫系統的重要組成部分[2]。研究顯示，支原體感染后，可誘導胎盤滋養層細胞表達多種細胞因子和炎性相關介質[3]。雖然支原體本身難以通過胎盤屏障，但是其感染導致細胞因子過度分泌，這對滋養層細胞具有毒性作用，也是引起不良妊娠發生的重要因素[4]。因此對于母體而言，如何負調控這些細胞因子的過度分泌，是維持胎兒發育的關鍵。人工合成的支原體巨噬細胞活化脂肽-2可誘導人單核細胞表達血紅素氧合酶-1(heme oxygenase-1，HO-1)，從而抑制炎癥因子的過度分泌[5]。但對于生殖支原體感染后，胎盤滋養層細胞能否表達HO-1目前仍不清楚。本文旨在觀察生殖支原體LAMPs能否誘導滋養層細胞表達HO-1，并探討其分子機制。

1 材料與方法

1.1材料生殖支原體G37標準株購自ATCC(ATCC?33530DTM)。小鼠抗人HO-1抗體、小鼠抗人核因子相關因子-2(nuclear factor-E2-related factor 2，Nrf2)抗體以及小鼠抗人TATA結合蛋白(TATA-binding protein，TBP)抗體購自Santa Cruz；抗磷酸化c-Src(Tyr416)和抗總c-Src單克隆抗體購自Cell Signaling；酪氨酸激酶c-Src抑制劑PP1，N-乙酰-半胱氨酸(N-acetyl-cysteine，NAC)以及2′,7′-二氯二氫熒光黃二乙酸酯(2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate，H2DCFDA)購自Sigma。HO-1活性檢測試劑盒購自上海GENMED公司；細胞蛋白提取試劑盒、蛋白濃度測定試劑盒購自Thermo公司；Lipofectamine 2000轉染試劑及新霉素(Normocin)購自Invitrogen公司；蛋白酶抑制劑購自Roche。用于分離滋養層細胞的胎盤絨毛組織來自2012年10月～2013年10月南華大學附屬第一醫院婦產科所收治的患者(孕18～31周)。開展研究前均與患者簽署知情同意書，研究內容和方法經過南華大學醫學倫理委員會的批準。

1.2方法

1.2.1 生殖支原體培養與LAMPs提取 生殖支原體標準株用SP4培養基于950 mL/L CO2、37 ℃條件下培養。當菌液由玫瑰紅變為橙色時，離心獲取菌體，根據參考文獻提供的方法提取LAMPs[6]。用5 mL Tris緩沖液(pH 8.0的50 mmol/L Tris、0.15 mol/L NaCl、1 mmol/L EDTA)重懸浮支原體沉淀，并加入終濃度為20 mL/L的Triton X-114，4 ℃靜置1 h，隨后37 ℃孵育30 min以促進相分離。棄上層水相，加入等體積Tris緩沖液后重復上述相分離1次。第2次相分離結束后，棄水相，用Tris緩沖液恢復至初始體積，加入2.5倍體積無水乙醇-20 ℃以沉淀LAMPs。超聲處理后測定其濃度備用。

1.2.2 滋養層細胞的分離與培養 按照參考文獻提供的方法分離鑒定滋養層細胞[7]。細胞用含100 mL/L胎牛血清以及50 mg/mL新霉素(Normocin)的M199培養基，于37 ℃、50 mL/L CO2的恒溫細胞培養箱中培養。實驗前將2×105個細胞接種于培養板中培養48 h，隨后用0.5～5 μg/mL LAMPs作用細胞4～12 h(視不同的實驗目的而定)[6]。

1.2.3 實時定量PCR檢測HO-1 mRNA的表達 細胞處理完畢后，用TRIzol試劑提取細胞總RNA，并取3 μg的RNA進行逆轉錄，將獲得的cDNA進行實時定量PCR。本文所用引物如下。HO-1上游引物為5′- ATGGCCTCCCTGTACCACATC-3′，HO-1下游引物為 5′-TGTTGCGCTCAATCTCCTCCT-3′;β-actin上游引物為5′-CATCCTGCGTCTGGACCTGG-3′，β-actin下游引物為：5′-TAATGTCACGCACGATTTCC-3′，在LightCycler96定量PCR儀(Roche)上按以下程序擴增：50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，58 ℃ 1 min共40個循環。PCR結束后計算各處理組中HO-1蛋白的相對表達量，計算公式：2-ΔΔCt，ΔΔCt=實驗組(CtHO-1-Ctβ-actin)-對照組(CtHO-1-Ctβ-actin)。

1.2.4 HO-1酶活性檢測 處理后的細胞加入1.5 mL的試劑A 漂洗細胞，隨后加入100 μL裂解液B充分混勻，超聲裂解細胞后于4 ℃，10 000 r/min離心15 min，獲取20 μL上清置于另一新的EP 管中，分別加入340 μL 緩沖液C、20 μL反應液D、20 μL 底物，混勻，37 ℃溫育60 min 。最后加入400 μL終止液終止反應。1 000 rpm 離心5 min。取100 μL綠色相，測量其在464 nm 和530 nm波長的吸光度，并根據待測樣品的蛋白濃度計算出HO-1 的活性，單位以每小時單位蛋白(mg)中膽紅素濃度(nmol/L)表示。

1.2.5 Western blot法檢測HO-1表達及Nrf2核轉位 滋養層細胞經LAMPs處理后，用預冷PBS漂洗2次，隨后加入含蛋白酶抑制劑的細胞裂解液充分裂解細胞，4 ℃ 12 000 r/min離心10 min。細胞漿和細胞核蛋白提取試劑盒嚴格根據廠家說明書進行。將獲取的蛋白經10%～12%的SDS-PAGE、轉膜，放入5%脫脂奶粉中封閉1 h；洗滌后，加入小鼠抗人HO-1或Nrf2抗體(1∶1 000)，4 ℃孵育過夜；多次洗滌后，加入辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標記的山羊抗小鼠二抗孵育1 h。ECL法發光、顯影。

1.2.6 活性氧(reactive oxygen species,ROS)檢測 以H2DCFDA為熒光探針檢測細胞內ROS水平。其原理是不發熒光的H2DCFDA進入細胞后能被過氧化物、氫過氧化物等氧化分解為二氯熒光黃而產生熒光。孵育結束后，向各管中加入終濃度5 μmol/L的H2DCFDA染液，37 ℃避光孵育30 min。PBS洗細胞3次，重懸細胞，SynergyHT熒光分光光度計(Bio-Tec)檢測細胞懸液熒光強度(激發波長485 nm，發射波長530 nm)。

1.2.7 Nrf2的siRNA瞬時轉染 將滋養層細胞接種于1.5 mL無血清的培養基的6孔板中，放入培養箱中備用。按LipofectamineTM 2000說明書配制A、B液并充分混合，靜置20 min后加入6孔板中，按試劑盒說明書要求，使siRNA終濃度達100 nmol/L，轉染4 h后換上完全培養基繼續培養。

2 結 果

2.1生殖支原體LAMPs誘導滋養層細胞表達HO-1 mRNA和蛋白在正常情況下，滋養層細胞中HO-1mRNA表達水平很低。用0.5 μg/mL LAMPs處理滋養層細胞12 h后，可明顯誘導HO-1 mRNA表達，隨著LAMPs濃度的增加，HO-1mRNA表達水平也逐漸升高(圖1A)。Western blot檢測結果顯示HO-1蛋白表達水平與mRNA的變化一致(圖1B)。

圖1 生殖支原體LAMPs對滋養層細胞HO-1表達的影響A：生殖支原體LAMPs誘導滋養層細胞表達HO-1 mRNA.與對照組(0 μg/mL)相比，*P<0.05，**P<0.01；B：生殖支原體LAMPs誘導滋養層細胞表達HO-1蛋白

2.2生殖支原體LAMPs上調滋養層細胞HO-1酶活性在正常情況下，滋養層細胞中HO-1酶活性水平很低。采用0.5 μg/mL LAMPs處理滋養層細胞12 h后，HO-1酶活性明顯增加，隨著LAMPs濃度的增高，HO-1酶活性也隨著之增強(圖2)，作用趨勢與HO-1的表達趨勢相似。

圖2 生殖支原體LAMPs對滋養層細胞HO-1酶活性的影響 與對照組(0 μg/mL)相比，*P<0.05

2.3酪氨酸激酶c-Src參與調控滋養層細胞HO-1的表達采用5 μg/mL的LAMPs處理滋養層細胞3 min后，即可誘導酪氨酸激酶c-Src的磷酸化，隨著LAMPs處理時間的延長，c-Src的磷酸化水平增加，處理10 min后c-Src的磷酸化水平反而降低(圖3A)。而使用10～30 μmol/L酪氨酸激酶c-Src抑制劑PP1預處理滋養層細胞1 h后，HO-1表達水平明顯降低(圖3B),PP1可以明顯抑制HO-1的表達。

圖3 酪氨酸激酶c-Src在生殖支原體LAMPs誘導滋養層細胞HO-1表達中的作用 A：生殖支原體LAMPs誘導滋養層細胞c-Src的磷酸化；B： PP1拮抗生殖支原體LAMPs誘導滋養層細胞HO-1的表達

2.4生殖支原體LAMPs誘導滋養層細胞表達HO-1與ROS的產生有關在正常情況下，滋養層細胞內有少量的ROS存在。生殖支原體LAMPs能明顯促使滋養層細胞生成ROS，隨著LAMPs的濃度增加，ROS的生成增多，而采用30 μmol/L PP1預處理滋養層細胞1 h后，ROS的生成顯著降低(圖4A)。生殖支原體LAMPs能顯著誘導滋養層細胞表達HO-1，而采用不同濃度的ROS抑制劑NAC預處理滋養層細胞4 h后，HO-1表達降低，NAC能拮抗LAMPs對滋養層細胞HO-1表達的誘導作用(圖4B)。

2.5生殖支原體LAMPs誘導滋養層細胞Nrf2核轉位在正常情況下，Nrf2可分布在細胞質和細胞核，但主要存在細胞質中。當用5 μg/mL LAMPs處理滋養層細胞1～2 h后，細胞核中Nrf2含量逐漸增多，且胞質中Nrf2含量隨之降低，而核蛋白內參TBP的含量保持恒定。而預先用ROS抑制劑NAC孵育后，LAMPs誘導滋養層細胞Nrf2核轉位的作用被明顯抑制(圖5)。

2.6 Nrf2參與調控滋養層細胞HO-1的表達在正常情況下，滋養層細胞中HO-1表達水平很低。5 μg/mL LAMPs能明顯誘導滋養層細胞HO-1的表達。而采用特異性siRNA干擾Nrf2表達后(圖6A)，再用5 μg/mL LAMPs處理滋養層細胞12 h，Western blot檢測結果顯示，HO-1的表達量明顯降低(圖6B)。

圖4 ROS在生殖支原體LAMPs誘導滋養層細胞表達HO-1中的作用 A：生殖支原體LAMPs誘導滋養層細胞產生ROS.與對照組(0μg/mL LAMPs)相比，*P<0.05，#P<0.05；B：NAC拮抗生殖支原體LAMPs誘導滋養層細胞表達HO-1

圖5 生殖支原體LAMPs對滋養層細胞Nrf2核轉位的影響

圖6 沉默Nrf2表達對滋養層細胞HO-1表達的影響 A：Nrf2 siRNA干擾效果；B：siRNA干擾沉默Nrf2表達后下調滋養層細胞HO-1的表達

3 討 論

LAMPs是生殖支原體重要的致炎物質，可誘導胎盤組織分泌多種炎性相關介質從而參與局部炎癥反應[9]。因此對于母體而言，支原體感染后必然存在某種負性調控機制以抑制過度的炎癥反應，從而維持胎兒的正常發育[9]。HO-1是催化血紅素降解為膽紅素、一氧化碳和Fe2+的限速酶。HO-1除了其固有的降解血紅素活性外，對炎癥反應也具有一定的調控作用[10]。本文LAMPs可顯著誘導滋養層細胞HO-1 mRNA和蛋白的表達，并上調其酶活性，而酪氨酸激酶c-Src抑制劑PP1明顯抑制HO-1的表達。HO-1的表達增加被認為是宿主細胞免受免疫病理損傷或應激損傷的一種適應性保護機制。由于血紅素是重要的促炎物質，HO-1促進血紅素的降解無疑是其調控細胞因子分泌的重要機制。此外，HO-1催化血紅素降解產物膽紅素、一氧化碳和Fe2+對炎癥介質的表達也具有一定程度的抑制作用。

本文同時也顯示LAMPs可顯著誘導ROS產生。ROS雖然有利于清除病原體，但其過度生成對宿主細胞DNA和蛋白具有毒性作用。在哺乳動物體內，ROS可反饋性激活Nrf2核轉錄因子，從而誘導HO-1等多種抗氧化相關蛋白的表達[11]。生理條件下Nrf2定位于細胞質中，在各種外源性刺激作用后，如感染，可引起細胞內ROS增多，隨后誘導Nrf2轉位至細胞核，與靶基因啟動子結合從而啟動其表達，參與調控細胞的抗氧化應激損傷以及炎癥反應[12]。LAMPs處理養層細胞60 min后，可顯著增加細胞核內Nrf2含量，并持續至2 h以上。這表明LAMPs可激活滋養層細胞內Nrf2。為了研究Nrf2的激活是否受ROS調控，本實驗采用ROS清除劑NAC處理滋養層細胞后，結果發現LAMPs誘導Nrf2核轉位的作用受到明顯抑制。同時，NAC也可抑制HO-1的表達，沉默Nrf2基因后，HO-1表達幾乎消失。以上結果表明LAMPs可能通過ROS/Nrf2途徑誘導滋養層細胞表達HO-1。但ROS激活Nrf2的機制目前仍不完全清楚，可能機制是當細胞內ROS濃度增高時，可促使Nrf2的抑制蛋白Keap1與其解離，從而使其轉移至細胞核，隨后Nrf2結合至靶基因的抗氧化反應元件，啟動下游保護性基因的轉錄。

總之，本研究證實生殖支原體LAMPs通過c-Src/ROS/Nrf2途徑上調滋養層細胞HO-1的表達。HO-1可能通過多種途徑調控炎癥介質及細胞因子的產生，最終反饋性調控炎癥反應的強度，這可能是機體一種獲得性的自我保護機制。

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MycoplasmaGenitalium-derivedLipid-associatedMembraneProteinsInducesPlacentalTrophoblastCellsExpressionofHO-1viaROS/Nrf2

HE Lu,YOU Xiaoxing,LI Guohua,et al

(DepartmentsofGynecology&Obstetrics,theFirstAffiliatedHospital,UniversityofSouthChina,Hengyang,Hunan421001,China)

ObjectiveTo investigate the mechanism of the expression of heme oxygenase-1 (HO-1) in response to Mycoplasma genitalium-derived lipid-associated membrane proteins (LAMPs) in placental trophoblast cells.MethodsPlacental trophoblast cells were cultured in vitro and stimulated by 0.5～5 μg/mL of LAMPs for 4～12h,expression of HO-1 mRNA and protein,and nuclear translocation of nuclear factor erythroid-2 related factor 2 (Nrf2) were detected by real-time PCR and Western blot,respectively.The enzyme activity of HO-1 was detected by colorimetric method.The intracellular formation of reactive oxygen species (ROS) was detected by using the fluorescent probe H2DCFDA.Tyrosine kinase c-Src inhibitor PP1,N-acetyl-cysteine (NAC) and Nrf2 siRNA were used to analyse the function of ROS and Nrf2 in mediating of HO-1 expression.ResultsM.genitalium LAMPs enhanced the expression of HO-1 at mRNA and protein levels as well as the enzyme activity of HO-1 in placental trophoblast cells in a concentration-dependent manner.In the meantime,LAMPs also induced placental trophoblast cells accumulation of ROS and nuclear translocation of Nrf2.PP1 and NAC treatment could inhibit LAMPs-induced HO-1 expression and Nrf2 nuclear translocation,and transfection of Nrf2 siRNA significantly abrogate HO-1 expression.ConclusionM.genitalium LAMPs induced placental trophoblast cells expression of HO-1 through c-Src/ROS/Nrf2 pathways.

mycoplasma genitalium; lipid-associated membrane proteins; heme oxygenase-1; placental trophoblast cells

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2015.04.002

2015-04-24；

2015-06-07

國家自然科學基金(31000091，81072418)；特殊病原體防控湖南省重點實驗室資助項目(湘科計字[2014]5號，湘教通〔2012〕312號).

*通訊作者，E-mail：21615930@qq.com.

R518.9,R392-33,R711.32

A

(此文編輯：蔣湘蓮)