WIF-1、DKK基因啟動子甲基化對COLO 320、HT-29細胞株β-catenin磷酸化的影響

，， ，

(南華大學附屬第一醫院消化內科，湖南 衡陽 421001)

·基礎醫學·

WIF-1、DKK基因啟動子甲基化對COLO 320、HT-29細胞株β-catenin磷酸化的影響

周徽，胡光勝，曾斌，廖愛軍

(南華大學附屬第一醫院消化內科，湖南 衡陽 421001)

目的探討Wnt抑制性基因甲基化對結直腸癌細胞株Wnt/β-catenin信號通路的影響。方法使用甲基特異性PCR和逆轉錄實時定量PCR方法，分別檢測結直腸癌細胞株COLO 320、HT-29及正常細胞株CCD-18Co中WIF-1、DKK-1、DKK-3的啟動子CpG島甲基化、mRNA水平，和測定β-catenin蛋白磷酸化情況，并觀察5-氮雜-2′-脫氧胞苷(5-aza-dC)去甲基化對各指標的影響。結果COLO 320細胞的DKK-1及DKK-3 mRNA水平明顯降低、甲基化程度高；HT-29細胞的DKK-3、WIF-1 mRNA水平低、甲基化程度高；兩個腫瘤細胞株的β-catenin蛋白總量均明顯增高，且主要為非磷酸化的狀態。5-aza-dC可減少這些指標的改變。結論抑制性基因甲基化調節的Wnt/β-catenin通路的異常激活，可能在結直腸癌的形成中有重要作用。在不同的腫瘤細胞株之間、不同Wnt抑制基因的甲基化程度存在差異；該領域的深入研究有助于開發出新的治療藥物。

Wnt/β-catenin信號通路； 甲基化； 結直腸癌； 表觀遺傳學

Wnt信號通路在多細胞生物中高度保守，在胚胎發育、內環境自穩和腫瘤發生等多種生物學過程中發揮著重要的調控作用。例如，經典的Wnt/β-catenin信號通路的異常激活是大多數結直腸癌的早期事件，其中約80%患者攜帶有導致APC(adenomatous polyposis coli)基因功能缺失的突變，5%攜帶有引起β-catenin活化的突變[1- 2]。Wnt/β-catenin信號通路還是腫瘤維持和轉移所必需的[3]。

在Wnt/β-catenin信號通路的上游，Wnt拮抗物的失活與腫瘤的發生密切相關。Wnt的拮抗物主要有兩大類：能直接結合Wnt蛋白、抑制Wnt/β-catenin通路活性的WIF-1(Wnt抑制因子-1)、sFRP家族等；以及能結合Wnt受體復合物中的低密度脂蛋白受體相關蛋白5和6(LRP 5/LRP 6)的DKK(Dickkopfs)家族。已證明WIF-1[4]、sFRP[5]和DKK[6]的表觀遺傳學改變以及表達異常與消化道腫瘤密切相關。本文則著重觀察在不同結直腸癌細胞株中，WIF-1與DKK基因啟動子的甲基化、mRNA及蛋白的水平，及其對β-catenin水平的影響。

1 材料與方法

1.1細胞系結直腸腺癌細胞系COLO 320、HT-29均購自中國典型培養物保藏中心(湖北省武漢市)：正常的結直腸細胞株CCD-18Co(CRL-1459)購自美國ATCC。細胞培養基為10%胎牛血清的DMEM。

1.2去甲基化處理收集對數增長期的培養細胞,使用5 μmol/L 的5-氮雜-2′-脫氧胞嘧啶核苷 (5-aza-2′-deoxycytidine，5-aza-dC，Sigma-Aldrich) 孵育72 h以進行去甲基化處理。處理結束后立即收集細胞提取RNA進行檢測。

1.3 RNA的提取、逆轉錄和WIF-1、DKK的實時熒光RT-PCR定量檢測每個樣品使用約106個細胞，使用QIAamp RNA mini kit (Qiagen)按說明提取總RNA；使用SuperScript Ⅲ及隨機引物進行逆轉錄；使用TaqMan universal PCR master mix(Applied Biosystems)，按說明書及參照文獻[7]，對以下基因進行實時熒光RT-PCR定量檢測。DKK-1(TaqMan Gene Expression Assay)；DKK-3(正向引物：5′-GTA AGT TTC CCC TCT GGC TTG-3′,反向引物：5′-AAG CAC CAG ACT GTG AAG CCT-3′，探針：FAM-5′- AGG TGT TGT GCA TTT GTT CAG CTC CC-3′-TAMRA)；WIF-1(正向引物：5′-TCC AAA CAC CTC AAA ATG CTA TC-3′，反向引物：5′-GAA CCC ATC AGG ACA CTC GC-3′，探針：FAM-5′-ACA AGC TGA GTG CCC AGG CGG-3′-TAMRA)和內參GAPDH(正向引物：5′-CCA CTC CTC CAC CTT TGA C-3′,反向引物：5′-ACC CTG TTG CTG TAG CCA-3′，探針：FAM-5′-TTG CCC TCA ACG ACC ACT TTG TC-3′-TAMRA)。使用ABI 7500進行檢測，反應條件為：95 ℃ 10 min和35 個周期的95 ℃ 15 s,60 ℃ 60 s。每個樣品測3個重復孔。數據分析時參考文獻[8]，計算靶基因與GAPDH 參照基因Ct值的比值。

1.4 DNA的提取和甲基化特異PCR(MSP)檢測

采用QIAamp DNA mini kit (Qiagen) 提取、純化培養的腸癌細胞和正常細胞CCD-18Co的DNA。按文獻方法[9]使用亞硫酸氫鹽對DNA進行修飾并進行MSP檢測。引物序列參照文獻[6,9]分別為：

甲基化特異的引物：DKK-1： 5′-CGT TCG TTG GTA GTT TTT ATT TCG A-3′ (正向)； 5′-GCG ACT ACC TTT ATA CCG CGA A-3′(反向)；DKK-3： 5′-CGG TTT TTT TTC GTT TTC GGG-3′(正向)，5′-CAA ACC GCT ACA TCT CCG CT-3′(反向)；WIF-1：5′-GGG CGT TTT ATT GGG CGT AT-3′(正向)，5′-AAA CCA ACA ATC AAC GAA C-3′ (反向)。

非甲基化的特異引物為:DKK-1：5′-TGT TTG TTG GTA GTT TTT ATT TTG A-3′，5′-ACC ACA ACT ACC TTT ATA CCA CAA A-3′；DKK-3：5′-TTT TGG TTT TTT TTT GTT TTT GGG-3′；5′ -CCA AAC CAC TAC ATC TCC ACT-3′；WIF-1：5′-GGG TGT TTT ATT GGG TGT AT-3′(forward)，5′-AAA CCA ACA ATC AAC AAA AC-3′(reverse) 。主要步驟為：PCR 反應條件：94 ℃預變性 12 min：94 ℃變性 1 min，退火 45 s，72 ℃延伸 40 s，40個循環后 72 ℃延伸 10 min，4 ℃保存。使用正常人外周血單個核細胞(PBMC)提取的DNA經SssI甲基化酶處理后作為甲基化分析的陽性對照，未經處理的作為非甲基化的陰性對照。 甲基化(M)和非甲基化(U)特異PCR的產物電泳后，使用TANON GIS凝膠成像分析系統進行半定量分析，計算其光密度的相對比例。

1.5 β-catenin的Westernblot檢測將106細胞直接以收集細胞加入裂解液裂解后收集上清，以BCA 蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度后,將蛋白進行SDS-PAGE 電泳分離,并轉移至PVDF 膜(Immobilon-P,Millipore)上，采用5%脫脂奶粉室溫封閉3 h，進行抗體標記。 所用抗體為小鼠anti-β-catenin (BD Transduction Laboratories)、小鼠anti-Actin (Sigma)、兔多克隆抗人DKK-1、DKK-3、WIF-1(Abcam)和兔抗人磷酸化β-catenin (pS33/pS37/pT41) (Cell Signalling Technologies)，以及辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG、兔抗小鼠IgG(Abcam)。使用ECL Western blotting 檢測試劑 (Pierce)進行顯色及VersaDoc MP4000 (Bio-rad)進行分析。

1.6統計分析使用IBM SPSS version 20.0進行統計分析。組間比較采用方差分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1不同細胞株中WIF-1、DKK-1、DKK-3 mRNA表達的改變根據不同靶基因對GAPDH基因的比值，以正常細胞CCD-18Co為參照，計算出COLO320和HT-29不同基因的改變倍數。圖1可以看出COLO320細胞的DKK-1和DKK-3 mRNA表達明顯下降(P<0.01)；而WIF-1改變不明顯。而HT-29細胞的DKK-3 和WIF-1 mRNA水平明顯下降(P<0.01)，DKK-1改變不明顯。而經5-aza-dC干預后，均有所回調，但依然明顯低于正常細胞。

2.2不同細胞株中WIF-1、DKK-1、DKK-3啟動子甲基化程度的檢測使用甲基化特異PCR以及非甲基化特異PCR進行檢測發現，CCD-18Co的WIF-1、DKK-1、DKK-3等3個基因啟動子均處于非甲基化狀態；COLO320的DKK-1和DKK-3基因啟動子處于高度甲基化、WIF-1處于非甲基化狀態；而HT-29的DKK-3和WIF-1基因啟動子處于高度甲基化，DKK-1處于非甲基化狀態。

圖1 不同細胞株中WIF-1、DKK-1、DKK-3 mRNA表達的改變 注：相對于未經5-aza-dC處理的CCD-18Co細胞株(標化為“1”)，DKK-1(A)、DKK-3(B)和WIF-1(C)mRNA在COLO320、HT-29細胞中表達的水平及經5-aza-dC處理后改變的倍數

經5-aza-dC干預后，CCD-18Co的3個基因依然保持于非甲基化的狀態；而COLO320高甲基化的DKK-1、DKK-3均明顯減弱，并擴增出了部分未甲基化的條帶。相似的，HT-29高甲基化的DKK-3和WIF-1在5-aza-dC干預后，也出現了MSP條帶減弱、并擴增出了非甲基化的條帶(圖2)。

2.3不同細胞株中DKK-1、DKK-3和WIF-1蛋白的表達使用Western Blot對不同細胞株DKK-1、DKK-3和WIF-1蛋白的表達水平進行分析，研究發現，CCD-18Co的DKK-1、DKK-3和WIF-1蛋白均處于較高表達水平，5-aza-dC處理后無明顯改變。COLO 320 表達DKK-1和WIF-1微弱；5-aza-dC處理后DKK-1明顯增強、WIF-1也略有增加但依然處于極低水平。DKK-3則始終有較高表達。而HT-29的DKK-1表達處于較高水平，DKK-3和WIF-1表達微弱，5-aza-dC處理后略有增加(圖3)。

圖2 不同細胞株中WIF-1、DKK-1、DKK-3 基因甲基化的狀態 注：M：甲基化特異PCR。U：非甲基化特異PCR?！?”為5-aza-dC處理組；“-”為未處理組。Control為陽性對照(M.DNA：甲基化的DNA)和陰性對照(PBMC：正常人PBMC提取的 DNA)

圖3 不同細胞株中DKK-1、DKK-3和WIF-1蛋白的表達水平 注：“+”為5-aza-dC處理組；“-”為未處理組

2.4 β-catenin含量分析Wnt/β-catenin的異常活化最終體現為β-catenin的磷酸化減少、以及隨后的泛素化降解減少。而在本文中相對于CCD-18Co細胞，COLO320和HT-29細胞都存在β-catenin總量增高、且Ser33/37和Thr41磷酸化β-catenin水平低的情況，提示非磷酸化的β-catenin增高。而經5-aza-dC干預后，COLO320和HT-29細胞β-catenin總量均降低、磷酸化β-catenin含量升高(圖4)。

3 討 論

Wnt信號經典通路——Wnt/β-catenin通路在多個重要的生物學過程中發揮著重要的調控作用。Wnt/β-catenin通路主要為：在存在Wnt活化信號時，Wnt結合至其受體frizzled(Fzd)和LRP 5/LRP 6，阻止了β-catenin被AXIN/ APC/ GSK3/ CK1復合體磷酸化、進而被泛素化及蛋白酶體降解。因此，

圖4 不同細胞株中β-catenin和磷酸化-β-catenin的水平注：“+”為5-aza-dC處理組；“-”為未處理組

β-catenin在胞質中聚集、并轉位進入細胞核，作為轉錄因子TCF/LEF家族的輔因子，導致多個Wnt/β-catenin靶基因的轉錄，如Axin2、Smad7、Ccnd1/CyclinD和Myc等。因此，如能影響Wnt抑制因子的表達，則可能在Wnt/β-catenin通路上游抑制該通路的激活，產生包括抑制腫瘤生長、轉移在內的廣泛的調節作用。

基因的表觀遺傳學修飾是一種不依賴DNA序列改變的、可逆的基因表達調控過程。基因啟動子甲基化等表觀遺傳學修飾與癌癥的發生密切相關[10-11]。本研究則進一步證實，在結直腸癌細胞株COLO320及HT-29中，Wnt抑制基因的mRNA表達、基因啟動子高度甲基化與相應的蛋白表達水平基本吻合。如COLO320的DKK-1和DKK-3 mRNA較低，其基因啟動子也處于高甲基化狀態，蛋白表達也相應較低。而HT-29中DKK-3和WIF-1的表達情況與之類似。同時，COLO320和HT-29的β-catenin總量均有所增加、磷酸化的β-catenin減少。

本研究的結果說明，這兩個結直腸癌細胞株中，均存在Wnt抑制基因的甲基化修飾異常、以及Wnt/β-catenin通路異?；罨?。這一改變可能參與了結直腸癌的形成。因此，已有研究嘗試以糞便檢查SFRP1和WIF-1基因甲基化的程度來幫助篩查腸癌[12]。本研究還發現，在COLO320、HT-29這兩個不同的結直腸癌細胞珠中，不同Wnt抑制基因的甲基化和轉錄水平是存在差異的；而去甲基化處理可以部分下調Wnt/β-catenin通路的異?；罨?。提示該通路可能成為新的結直腸癌的治療靶點。

[1] Cancer Genome Atlas Network.Comprehensive molecular characterization of human colon and rectal cancer[J].Nature,2012,487(7407):330-337.

[2] Humphries A,Wright NA.Colonic crypt organization and tumorigenesis[J].Nat Rev Cancer,2008,8(6):415-424.

[3] Scholer-Dahirel A,Schlabach MR,Loo A,et al.Maintenance of adenomatous polyposis coli (APC)-mutant colorectal cancer is dependent on Wnt/beta-catenin signaling[J].Proc Natl Acad Sci USA,2011,108(41):17135-17140.

[4] 王玲,張煦,王連.大腸癌中WIF-1和Wnt2b的表達及其臨床意義[J].臨床與實驗病理學雜志,2012,28(06):613-615，619.

[5] 譚華斌,盧光新.胃癌組織中SnoN、Egr3和SFRP1的表達情況及臨床意義[J].臨床腫瘤學雜志,2014,19(10):901-905.

[6] 李春輝,潘理會,佟曉波,等.Wnt信號通路的組件蛋白DKK-1、β-鏈接素及周期素D1蛋白表達與胃癌的相關性[J].中國老年學雜志,2015,35(05):1171-1173.

[7] Ding Z,Qian YB,Zhu LX,et al.Promoter methylation and mRNA expression of DKK-3 and WIF-1 in hepatocellular carcinoma[J].World J Gastroenterol,2009,15(21):2595-2601.

[8] Schmittgen TD,Livak KJ.Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method[J].Nat Protoc,2008,3(6):1101-1108.

[9] Mazieres J,He B,You L,et al.Wnt inhibitory factor-1 is silenced by promoter hypermethylation in human lung cancer[J].Cancer Res,2004,64(14):4717-4720.

[10] Yamamoto E,Suzuki H,Takamaru H,et al.Role of DNA methylation in the development of diffuse-type gastric cancer[J].Digestion,2011,83(4):241-249.

[11] Voorham QJ,Janssen J,Tijssen M,et al.Promoter methylation of Wnt-antagonists in polypoid and nonpolypoid colorectal adenomas[J].BMC Cancer,2013,13(19):603.

[12] 張虎,張平,江軍,等.糞便標本中SFRP1和WIF-1基因啟動子甲基化在大腸癌早期篩查中的意義[J].山東醫藥,2014,54(33):54-56.

HypermethylationofWIF-1andDKKGeneFamilyontheβ-cateninPhosphorylationinColorectalAdenocarcinomaCellLinesCOLO320andHT-29

ZHOU Hui,HU Guangsheng,ZENG Bin,et al

(DepartmentofDigestion,theFirstAffiliatedHospital,UniversityofSouthChina,Hengyang,Hunan421001,China)

ObjectiveTo reveal the the effect of methylated inhibitory genes on Wnt/β-catenin pathway in colorectal adenocarcinoma cell lines.MethodsWith colorectal adenocarcinoma cell lines COLO 320,HT-29 and normal colorectal cell line cCCD-18Co,methylation status of CpG island in promotor of WIF-1,DKK-1 and DKK-3 genes were determined by methylation specific PCR (MSP),and mRNA levels of these genes were quantified by real-time RT-PCR,and phosphorylated β-catenin were semi-quantified by Western blot.Effect of DNA-demethylating agent 5-aza-2′-deoxycytidine (5-aza-dC) treatment were also evaluated.ResultsDKK-1and DKK-3 mRNA decreased accompanied with hypermethylation status of the CpG islands in COLO 320,while DKK-3 and WIF-1 mRNA decreased accompanied with hypermethylation in HT-29.Total β-catenin increased significantly while phosphorylated β-catenin declined in both cell lines.5-aza-dC ameliorated these aberrant parameters partially.ConclusionThe aberrant activation of Wnt/β-catenin pathway mediated by the hypermethylation of WIF-1 and DKKs genes may contribute to the oncogenesis of colorectal adenocarcinoma,while the methylation level of different Wnt inhibitory genes varied in colorectal cancer cell lines.Further research on this field will prompt the development of new therapies targeting the methylation process.

WNT/β-catenin signaling pathway； hypermethylation； colorectal adenocarcinoma； epigenetics

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2015.04.006

2015-04-30；

2015-06-12

衡陽市科學技術局科技計劃(編號：2011KJ64).

Q279

A

(此文編輯：蔣湘蓮)