羅格列酮對膿毒癥大鼠血糖及肺部炎癥反應的影響

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(南華大學附屬第一醫院兒科，湖南 衡陽 421001)

·基礎醫學·

羅格列酮對膿毒癥大鼠血糖及肺部炎癥反應的影響

周靈芝*，張熠,康婷,高順利

(南華大學附屬第一醫院兒科，湖南 衡陽 421001)

目的探索羅格列酮對膿毒癥大鼠血糖及肺部炎癥反應的影響。方法采用結腸結扎穿孔法建立膿毒癥大鼠模型，36只SD大鼠隨機分為3組，分別為膿毒癥組、羅格列酮處理組和假手術組，每組12只。分別于造模后12 h，24 h行血漿血糖檢測；HE染色及髓過氧化物酶(MPO)活性檢測觀察肺組織中性粒細胞聚集情況；熒光定量PCR檢測肺組織炎癥因子IL-6、TNF-α的表達變化。每時間點檢測大鼠6只。結果與假手術組比較,膿毒癥組組大鼠肺部炎癥因子IL-6、TNF-α表達增高。肺組織微血管通透性增加,肺泡壁增厚,間質水腫,白細胞浸潤,MPO活性明顯增強(P<0.05)；與膿毒癥組比較,羅格列酮處理組肺間質水腫程度減輕,白細胞浸潤減少,炎癥因子的表達受到抑制(P<0.05)。三組大鼠各時間點血糖差別不明顯(P>0.05)。結論羅格列酮能夠降低膿毒癥大鼠肺組織炎癥因子IL-6、TNF-α的表達，減輕炎癥反應。但對大鼠血糖無明顯影響。

羅格列酮； 膿毒癥； 肺； 炎癥反應

膿毒癥是由感染導致的全身炎癥反應綜合征(system in flammatory response syndrome,SIRS),是嚴重創傷、休克、外科大手術后常見的并發癥。膿毒癥時，由于炎癥介質的“瀑布樣釋放”可導致多器官功能障礙綜合征(multi organ dysfunction syndrome,MODS)，其中肺臟是最易受累的器官。研究發現過氧化物酶體增殖物激活受體γ激動劑羅格列酮(Rosiglitazone ROSI)可通過抑制炎癥介質的表達而減輕炎癥反應,ROSI在膿毒癥及缺血再灌注損傷發生過程中都發揮著抗炎作用。本文就ROSI對結腸結扎穿孔模型大鼠血糖及肺部炎癥反應的干預作用進行研究。

1 材料與方法

1.1動物分組與處理SD大鼠36只,體重250～300 g,雌雄不拘，由南華大學實驗動物部提供。實驗前及實驗過程中自由攝食、飲水。動物隨機分為3組，膿毒癥組、羅格列酮處理組(ROSI 0.3 mg/kg)和假手術組。每組12只。膿毒癥組:行盲腸結扎穿孔術。假手術組:開腹，暴露盲腸，不行盲腸結扎穿孔術。羅格列酮處理組:手術同膿毒癥組，術后立即尾靜脈注射稀釋后(0.3 mg/mL)的羅格列酮,以后每12 h一次。A,C組均按體重計算注射等量生理鹽水。造模后12 h、24 h氯胺酮麻醉處死大鼠留取標本。各組大鼠均監測體溫、呼吸頻率、血壓、心率及攝食狀況。

1.2主要試劑與儀器羅格列酮購自美國Cayman公司；髓過氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)比色活性檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；HE染色試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司；熒光定量PCR檢測試劑盒購自北京天根公司；Trizol購自invitrogen公司；引物合成由上海生物工程有限公司完成(IL-6:上游引物5-AGCCCACCAGGAACGAAAGTC-3下游引物,5-TGGAAGTTGGGGTAGG AAGGA-3,片段大小559bp；TNF-α:上游引物5-TGCCTCAGCCTCTT CTCATT-3 下游引物5-GCTTGGTGGTTTGCTACGAC-3，片段大小209bp;GAPDH:上游引物5-GTCAGTGGTGGACCT GACCT-3 下游引物5-AGGGGTCT ACATGGCAACTG-3，片段大小420 bp)。

1.3檢測指標及方法

1.3.1 血常規及血糖檢測 大鼠頸動脈采血后立即采用上海ABX全自動血細胞分析儀檢測血常規，日本東芝全自動生化儀檢測全血葡萄糖濃度。

1.3.2 肺組織形態學觀察 右肺中葉用10%甲醛固定,常規石蠟切片。進行蘇木精—伊紅(HE)染色,普通光鏡下觀察肺組織的肺泡充血、水腫及炎癥細胞浸潤情況。

1.3.3 MPO活性測定 準確稱取肺組織重量100 mg/例,剪碎組織塊,與配制好的勻漿介質按重量體積比1:19勻漿(10000r/min、勻漿液1 mL),制備成5%的組織勻漿。檢測按照試劑盒說明書進行。

1.3.4 炎癥因子檢測 大鼠處死后，立即取新鮮左下肺新鮮標本以預冷的PBS沖洗干凈后立即液氮研磨，Trizol法提取總RNA，按cDNA第一鏈合成試劑盒說明書逆轉錄，北京天根公司染色法熒光定量PCR試劑盒行PCR檢測。

2 結 果

2.1膿毒癥大鼠模型的建立參照Remick DG等關于盲腸結扎穿孔術膿毒癥大鼠模型的手術方式及診斷標準，膿毒癥組及羅格列酮處理組大鼠術后12 h均出現攝食減少、發熱癥狀，肛溫平均增加1.5 ℃；呼吸頻率較術前增加1倍；心率較術前增加50%；白細胞增升高1倍以上，符合膿毒癥大鼠診斷標準。假手術組大鼠術后12 h攝食基本正常，體溫、心率、呼吸變化不明顯。白細胞稍有上升，但較術前增加不到1倍。

2.2血糖的檢測如表1所示，三組大鼠各時間點血糖水平無明顯差異(P>0.05)。

表1各組大鼠血漿葡萄糖濃度檢測(mmol/L)

組別0h12h24h膿毒癥組4.45±0.895.38±1.086.12±1.12ROSI組4.36±0.714.31±0.915.78±0.95假手術5.46±0.955.53±1.124.50±0.89

2.3肺組織形態學改變如圖1所示，假手術組小鼠肺組織小葉結構清晰,肺泡腔干凈,肺泡間質少量炎性細胞浸潤,肺泡壁無增厚,支氣管黏膜上皮完整。膿毒癥組肺組織充血明顯,肺泡間質有大量炎性浸潤,肺泡壁增寬,肺泡腔內可見炎性滲出,肺組織病理改變12～24 h逐漸加重。ROSI處理后肺組織充血程度、肺泡間質炎性浸潤和滲出較膿毒癥組明顯改善,肺泡壁無明顯水腫。

圖1 各組大鼠肺部組織病理變化(HE，100×) A：膿毒癥組；B:羅格列酮處理組；C：假手術組

2.4肺組織MPO活性的變化結果表明,與假手術組比較,膿毒癥組術后12,24 h,小鼠肺部MPO活性均顯著增強,ROSI干預后,MPO活性明顯降低。結果見圖2。

圖2 ROSI對膿毒癥大鼠肺組織MPO的干預作用 與膿毒癥組比較，*：P<0.05，**：P<0.01

2.5炎癥因子的變化建模后12 h，24 h各組大鼠肺部炎癥因子水平如圖3、4所示。膿毒癥組IL-6、TNF-αmRNA水平在12 h、24 h逐漸增高。ROSI處理組在12 h、24 h IL-6、TNF-αmRNA水平有增高，但高峰水平低于同期膿毒癥組(P<0.05)。假手術組炎癥因子各時間點變化不明顯且低于同期其他兩組(P<0.05)。

3 討 論

羅格列酮通過與過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator activated receptors gamma,PPARγ)結合，使PPARγ/RXRα發生空間構象改變，與輔抑制因子脫離并結合輔激活因子，進而與靶基因啟動子上的PPAE結合，激活靶基因轉錄而激活細胞內信號通路發揮其作用。PPARγ活化可以調控NF-κB和AP-1信號轉導通路，在轉錄水平抑制IL-6、TNF-α的表達而發揮抗炎作用。研究表明羅格列酮與吡格列酮可以抑制支氣管哮喘、動脈硬化、炎癥性腸病等器官的慢性炎癥反應，減輕病變部位中性粒細胞及淋巴細胞的浸潤與炎癥因子的表達。二者能夠減輕膿毒癥大鼠的全身炎癥反應，而對于膿毒癥最易損傷的肺臟，羅格列酮對肺部炎癥細胞浸潤、炎癥因子表達及其對大鼠血糖的影響目前尚無報道。

圖3 ROSI對膿毒癥大鼠肺組織IL-6 mRNA表達的影響與假手術組比較，**：P<0.01。與膿毒癥組及假手術組比較，*：P<0.05

圖4 ROSI對膿毒癥大鼠肺組織TNF-α mRNA表達的影響 與假手術組比較，**：P<0.01；與膿毒癥組組比較，*：P<0.05

本研究通過采用盲腸結扎穿孔術構建膿毒癥大鼠模型，通過羅格列酮尾靜脈注射的方法，研究發現，盲腸結扎穿孔后12小時大鼠出現明顯全身炎癥反應表現，達到膿毒癥診斷標準，此時大鼠肺組織已經受累，表現為組織MPO活性明顯增高，肺泡間質充血及炎性細胞浸潤,肺泡壁增寬,肺泡腔內可見炎性滲出。而羅格列酮治療能降低組織MPO活性，減輕肺組織充血程度，減少肺泡間質炎性浸潤,減輕肺泡壁水腫。各組大鼠肺部炎癥因子檢測也表明，膿毒癥組大鼠12～48小時肺部炎癥因子TNF-α、IL-6水平逐漸增高。而予以羅格列酮治療后，TNF-α、IL-6水平有明顯減低。這一實驗結果提示，羅格列酮在盲腸結扎穿孔導致的膿毒癥大鼠肺損傷中具有明確的抑制炎癥介質釋放，減輕炎癥反應的作用。

為了明確羅格列酮在減輕膿毒癥炎癥反應的同時對血糖的影響情況，本實驗同時檢測了各組大鼠的血糖，研究發現，三組大鼠各時間點血糖無明顯差異，未因羅格列酮降糖作用而出現低血糖。我們分析其原因可能是膿毒癥組大鼠炎癥因子水平增加最高，全身炎癥反應導致的應激最為強烈，此時大鼠攝食基本停止，機體血糖水平依靠應激性升高維持在正常。ROSI組大鼠炎癥反應相對較輕，可以適當攝食，羅格列酮對血糖降低的影響通過大鼠攝食及炎癥應激所導致的升高得到調控，因此血糖也維持在正常范圍。假手術組大鼠基本無明顯炎癥反應，攝食正常，血糖穩定在正常水平。當然，其確切的血糖調控機制還有待進一步實驗研究闡明。

綜上所述，本研究表明，羅格列酮能夠降低膿毒癥大鼠肺組織炎癥因子IL-6、TNF-αmRNA的表達，減輕炎癥反應。但對大鼠血糖無明顯影響且不會導致低血糖發生。本研究可能為羅格列酮的臨床應用及膿毒癥的藥物治療提供新的思路。

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EffectofRosiglitazoneontheBloodGlucoseandPulmonaryInflammationinSepticRats

ZHOU Lingzhi,ZHANG Yi,KANG Ting,et al

(DepartmentofPediatrics,theFirstAffiliatedHospital，UniversityofSouthChina，Hengyang421001,Hunan,China)

ObjectiveTo explore the effect of rosiglitazone on the control of blood glucose and pulmonary inflammation in septic rats.MethodsThe model of septic rat was established by ligation and puncture on the colon.36 SD rats were randomly divided into three groups,they were sepsis group,sepsis with rosiglitazone intervention group (ROSI 0.3 mg/kg) and sham-operated group,12 rats in each group.Blood glucose was tested 12 and 24 hours after intervention.IL-6，TNF-α expression level in lung tissue were detected by quantitative PCR.Neutrophil aggregation status was observed by HE staining and myeloperoxidase (MPO) activity detection.6 rats were executed in each time.ResultsCompared with sham-operated group,TNF-α and IL-6 mRNA expression level in sepsis group were obviously increased.The permeability of lung microvascular,thickness of alveolar wall,edema of interstitial and activity of MPO were significantly enhanced in sepsis group (P<0.05);Compared with sepsis group,the inflammatory cytokines expression level and the degree of lung inflammation in rosiglitazone intervention group were significantly reduced (P<0.05).There were no differences in blood glucose level between three groups.(P>0.05).ConclusionRosiglitazone can inhibit the expression of TNF-α and IL-6 and reduce inflammation response in septic lung tissue without influence on blood glucose.It has certain effect on septic lung injure.

rosiglitazone; sepsis; lung; inflammation

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2015.04.008

2014-06-22；

2015-03-013

*通訊作者，E-mail：lingzhi.zhou@163.com.

R631

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(此文編輯：秦旭平)