A族鏈球菌M蛋白相關疫苗的研究進展

袁 婷，關曉菲（綜述），馬翠卿（審校）

（河北醫科大學基礎醫學院免疫學教研室，河北省重大疾病免疫機制及干預重點實驗室，河北石家莊050017）

A族鏈球菌M蛋白相關疫苗的研究進展

袁 婷，關曉菲（綜述），馬翠卿*（審校）

（河北醫科大學基礎醫學院免疫學教研室，河北省重大疾病免疫機制及干預重點實驗室，河北石家莊050017）

釀膿鏈球菌；疫苗；綜述文獻

A族鏈球菌（group A streptococcus，GAS）也稱化膿性鏈球菌，是最常見的也是致病性最強的革蘭陽性菌之一，其可以引起多種感染性疾病如扁桃體炎、急性咽炎、喉炎、風濕熱、猩紅熱及嚴重的毒性休克綜合征。值得關注的是GAS感染后還可以導致嚴重的變態反應性疾病如風濕性心臟病、急性腎小球腎炎等。國內外從來沒有停止過對GAS疫苗的研究，主要聚焦于免疫原性強的M蛋白，現就以M蛋白為基礎的疫苗研究進展綜述如下。

1 GAS的流行病學

GAS廣泛存在于自然界、健康人的咽喉部以及人和動物的糞便中，通過空氣、皮膚接觸等方式傳播。據世界衛生組織報道，全球每年約有517 000例患者死于鏈球菌感染所致的各種疾病，其中約30%死于鏈球菌的侵襲性感染，近70%死于鏈球菌感染后所致的風濕熱、風濕性心臟病、急性腎小球腎炎等疾病［1］。我國廣東省、吉林省、浙江省、湖北省及重慶市學齡兒童GAS年平均感染率為50%，部分農村地區GAS感染率高達70%～80%，GAS上呼吸道感染導致的風濕性心臟病在5個省市兒童中平均發病率達22／10萬［2］。

目前，治療GAS感染的主要措施為應用抗生素如青霉素、大環內脂類藥物，或靜脈注射免疫球蛋白。雖然沒有報道顯示GAS對青霉素有耐藥性，但相關研究證實青霉素在GAS咽炎的治療中失敗率達20%～40%［3］。而對大環內酯類敏感的GAS會利用生物膜形成隔離，成為逃避抗生素治療的機制從而在宿主體內殘留［4］。嚴重的GAS侵襲性感染，如鏈球菌毒性休克綜合征和壞死性筋膜炎，靜脈內注射免疫球蛋白以促進調理吞噬作為輔助治療手段，收到一定的療效，但免疫球蛋白的弊端是只能提供短期保護。就目前形勢來看，GAS感染已成為臨床治療中的棘手問題。所以，對于GAS的有效防治，除了控制傳染源外，應用疫苗成為最有效的措施。

2 GAS疫苗中有效成分的選擇

關于GAS疫苗的研究是基于鏈球菌的各種蛋白及成分，如M蛋白、C5a肽酶、外毒素B、A族碳水化合物、鏈球菌纖連蛋白結合蛋白1（streptococcal fibronectin binding protein 1，Sfb1）、血清不透明因子（serum opacity factor，SOF）和纖連蛋白結合蛋白54（fibronectin binding protein 54，FBP54）等構建并制備的亞單位疫苗，但因各種原因，迄今為止仍然沒有安全有效的GAS疫苗供人類使用［5－6］。最近一個時期，對GAS疫苗的研制進入了新時代。通過計算機輔助，利用反向疫苗學、蛋白質組學、生物信息學、全基因測序和DNA微陣列等先進技術，能快速發現并推斷毒力因子、表面相關蛋白和可能的候選疫苗。但GAS疫苗的發展仍然面臨著挑戰性。導致這一現象的原因可歸結為3個：①GAS的血清型眾多，而它們之間又很少存在交叉，很難制備針對所有流行菌株的疫苗；②缺乏合適有效的動物模型加以評價也是限制疫苗發展的原因之一；③在GAS疫苗應用中，最大的障礙是GAS某些免疫原性強的表面蛋白如M蛋白，與人體組織蛋白存在交叉反應，使得疫苗的應用面臨著誘發自身免疫病的風險。20世紀60年代末期，在使用天然的M蛋白制備疫苗試驗中發現［7］，接種疫苗組較對照組兒童風濕熱的發病率明顯增加。但是，其他GAS蛋白亞單位疫苗所誘發的免疫應答及預防作用都不及M蛋白，故到目前為止，M蛋白依然是GAS亞單位疫苗研究的重要的備選蛋白，但顯然對于GAS疫苗的研究策略有待改善。

3 M蛋白

M蛋白是GAS所有血清型都表達的一個重要致病因子。它是GAS細胞壁的蛋白抗原成分，以二聚體形式存在，由2條多肽鏈復合成一條α-螺旋卷曲固定在細胞表面，每條多肽鏈包含多達4個重復區域（記為A～D）。C-端為高度保守區，N-端通常是由一個高變區A區和一個半可變區B區構成（圖1）。

圖1 M蛋白結構示意圖

M蛋白是GAS抗吞噬作用的主要決定因素。基于M蛋白高變區的抗原特異性（Lancefield血清學分類法），已經確定的M蛋白血清型至少有150種。M蛋白不同區段的抗原異質性使其呈現出不同的功能，M蛋白的N端高變區可結合H因子、H因子樣蛋白和C4bp結構，C-端保守區也可結合H因子，這些因子均是經典補體途徑的調節因子，有助于抗吞噬作用，故GAS通過M蛋白結合補體調節蛋白以干擾補體介導的調理吞噬作用。另外，M蛋白的許多血清型的B區都可結合纖維蛋白原，同樣有助于抗吞噬作用。

4 M蛋白相關疫苗

由于M蛋白有較好的免疫原性和免疫保護性，可刺激機體產生保護性抗體，成為了疫苗研究的重點。M蛋白的抗原決定簇與人體多種組織抗原存在交叉性，包括心臟、骨骼肌球蛋白、原肌球蛋白、層黏連蛋白和角蛋白等［8］。研究［9］發現，M蛋白的調理表位與自身免疫性表位是分隔開的，大多數組織的交叉性表位被定位在B區、A-B側翼區或B-C側翼區，而在A區和C區中存在著與人體組織交叉反應同時又可以誘導機體產生調理性抗體的表位。據此，利用基因重組技術，M蛋白相關疫苗的研究有3個策略：①以多種血清型M蛋白N-端可變區片段為基礎制備多價多肽疫苗；②以M蛋白C-端保守區保護性表位為基礎制備多價多肽疫苗；③M蛋白融合其他蛋白的多肽疫苗。

4.1 基于M蛋白N-端的相關疫苗 M蛋白N-端可變區具有能夠激發產生最大殺菌活性抗體的表位，并且幾乎沒有與人體組織蛋白發生交叉反應的表位，所以對于該種疫苗的研究備受追捧。Kotloff等［10］成功重組構建了含有M24、M1、M3、M5、M6和M19蛋白血清型N-端片段的基因序列，該疫苗的動物實驗顯示，免疫血清中含有相應GAS血清型的調理性抗體，表明該抗體在大多情況下是針對M蛋白保護性抗原表位所產生的。該種疫苗的Ⅰ期試驗結果顯示6價M蛋白血清型片段所誘導的抗體滴度顯著增加，同時未檢測到該抗體與人體組織存在交叉反應。在此基礎上，由美國ID Biomedical Corporation公司研制出了26價多肽疫苗［11］，采用明礬佐劑免疫家兔，可產生特異性血清IgG抗體，在臨床Ⅰ期試驗中觀察到該疫苗具有良好的免疫原性及顯示出良好的安全性。美國2000－2004年5 400例GAS侵襲性感染病例中，分離出的79%的血清型與該26價疫苗一致［12］，提示該疫苗所包含的表位廣泛分布于該地區流行的鏈球菌菌株表面，揭示了該疫苗具有應用于該地區臨床的可能性。近日，Dale等［13］基于北美和歐洲時下流行的GAS血清型成功制備出30價疫苗，用此疫苗免疫家兔可得到能調理該30種血清型的抗血清。然而該疫苗的30種血清型僅能覆蓋馬里和南非GAS感染血清型中的40%和59%。由此可見，該種疫苗制備方法也存在弊端，M蛋白血清型眾多，不可能構建一種疫苗可包含所有血清型，這就要求根據某一地區、某一時段GAS的流行趨勢選取相應血清型設計疫苗，而該種疫苗只能對當地GAS感染有效，而且一旦流行菌株發生變化或出現新的菌株則保護效果大大降低。

4.2 基于M蛋白C-端的相關疫苗 到目前為止，已經有多種方法針對M蛋白C-端保守區保護性表位制備相關GAS疫苗。第1種方法是合成了4個涵蓋M6蛋白C-端重復區的重疊肽。使用該多肽滴鼻免疫Swiss CD1小鼠后，再用同源M6和異源M14 GAS分離株分別鼻內攻擊小鼠［14］，結果顯示GAS咽部定植均顯著減少。第2種方法是合成了M5蛋白C-端重復區的2種多肽。通過動物實驗的主動免疫和被動免疫發現［15］，針對M5多肽的血清IgG水平升高，但卻無法在體外誘導調理吞噬作用。第3種方法是通過識別M5蛋白C-端重復區內的T、B細胞表位，構建了長度為55個氨基酸的序列（StreptInCor）。對BALB／c小鼠皮下接種，StreptInCor和完全弗氏佐劑／不完全弗氏佐劑共同給予，結果發現可以誘導高滴度的血清IgG［16］。第4種方法是從M5蛋白C-端篩選出一段20個氨基酸的多肽（P145），并通過實驗衍生出2個序列，即含有M蛋白保守的B細胞表位及不與人體發生交叉反應的T細胞表位，分別命名為J8和J14。研究證明，J8和J14可以誘導小鼠血清特異性Ig G和Ig A［17］水平增高。第5種方法是基于M蛋白C-端重復區序列制備活疫苗。首先對CD1小鼠鼻內免疫接種表達M6蛋白C-端重復序列的牛痘病毒，再進行同源M6和異源M14 GAS分離株的鼻內攻擊，結果顯示可顯著減少GAS咽部定植。乳酸乳球菌是一種腸道共生菌群，也被用來作為活疫苗的載體，攜帶M6蛋白C-端重復區編碼的基因序列，對CD1小鼠行鼻內免疫接種該活疫苗后，導致唾液Ig A和血清IgG水平增高［18］。

4.3 M蛋白融合其他蛋白的多肽疫苗 FbaA（an Fn-binding protein expressed on the surface of GAS）是2001年發現的GAS表面的一種相關蛋白，具有較好的免疫原性，可誘發與M蛋白相當的保護性免疫應答，且Fba A蛋白在不同的GAS血清型中有很高的同源性。將純化的Fba A蛋白和M蛋白分別皮下免疫小鼠，2組的血清Ig G水平相似且Fba A免疫組的保護效果僅次于M蛋白免疫組，差異無統計學意義［19－20］。近期該課題組，利用噬菌體肽庫及單克隆抗體技術篩選出7個Fba A優勢表位，通過PCR技術將該表位同中國南方地區流行的4個GAS血清型的M蛋白相融合，構建出含有7個Fba A優勢表位和5個M蛋白片段的GAS疫苗（F7M5）。其中包括的5個M蛋白片段分別來自M1、M3、M6、M18的N端和C端的共同保守序列J14，將此多肽疫苗免疫小鼠，結果顯示小鼠血清Ig G水平相較單純應用上述5個血清型的多肽疫苗顯著升高。攻毒試驗顯示F7M5蛋白免疫組的保護率明顯高于其他對照組。表明該種融合疫苗誘導了較高的抗體水平和較好的保護率［21］。

5 展 望

在過去的幾十年里，對GAS疫苗的研究取得了很大進展，研究者除了研究以M蛋白為基礎的疫苗外，還把目光投到其他可能蛋白上，如C5a肽酶［22］、精氨酸脫亞胺酶［23］、鏈球菌分泌酯酶［24］、鏈球菌血紅素蛋白受體［25］等，但目前仍沒有安全有效的商用疫苗問世。總之，GAS疫苗研制中的一些影響因素需要綜合考慮，包括GAS血清型的地理分布差異、該抗原包含自身免疫表位的可能性、人類疫苗佐劑的選擇、設計合理有效的實驗動物模型等。就我國GAS疫苗研究領域而言，GAS相關流行病學資料的不足也是影響疫苗研發制備的因素。

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（本文編輯：趙麗潔）

R378.12

A

1007-3205（2015）01-0103-05

2014－05－15；

2014－07－11

國家自然科學基金資助項目（30901350）；河北省自然基金資助項目（H2012206076）

袁婷（1988－），女，河北廊坊人，河北醫科大學基礎醫學院醫學碩士研究生，從事感染免疫研究。

*通訊作者。E-mail：macuiqing＠sina.com

10.3969／j.issn.1007-3205.2015.01.041