大港油田產出水中微生物對正構烷烴的降解

（北京科技大學土木與環境工程學院，北京100083）

隨著社會經濟的發展，世界各國對石油的需求量日益增大。然而，石油在給人類社會發展帶來巨大推動作用的同時，也增加了對環境的污染。據報道，當前世界石油年產量約22 億t，但有800 萬t進入環境。我國石油年產量已超過1 億t，每年新污染土壤10萬t［1］。石油中含量最高的成分是各種鏈長的烷烴，特別是C8～C40的正構烷烴［2］。自20世紀80年代以來，生物修復以其無污染、費用低、效果好逐漸成為石油污染土壤修復的重要手段［3］。自然界中存在的能夠降解烷烴的微生物約有100余屬、200多種，分屬于細菌、放線菌、霉菌、酵母等［4］。目前，篩選能夠高效降解烷烴的微生物是研究的熱點［5－7］。但單菌只能降解特定類型的烷烴，難以對石油中所有烷烴達到很好的降解效果。油田產出水中存在大量能夠降解烷烴的微生物，通過對菌群進行活化可以提高烷烴的降解效果。

生物體內的各種代謝過程都伴隨著能量的轉移和熱變化。采用一般的檢測手段很難獲得滿意的結果，而微量量熱儀具有較高靈敏度（0.1μW）［8－9］，可連續檢測生物代謝過程所產生的熱量，對微生物的代謝活性進行實時、在線、原位的監測。

作者在此分別以十二烷、十六烷、原油為唯一碳源，測定大港油田3口油井產出水中微生物對正構烷烴的降解率，同時對產出水中微生物的代謝熱進行測定，進而分析代謝熱和降解率之間的相關性。

1 實驗

1.1 材料、試劑、培養基與儀器

油田產出水分別采自天津大港油田孔店區塊1032－4、1032－1、1050－2油井；原油取自大港油田三次采油工藝研究所。

正十二烷、正十六烷，分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

LB液體培養基；葡萄糖培養基；無機鹽培養基（g·L－1）：（NH4）2SO43，KH2PO40.5，Na2HPO4·12H2O 1.26，MgSO4·7H2O 0.54，微量元素液1 mL，pH 值7.0。

TOC－V 型總有機碳分析儀；AA－6300C型火焰原子吸收儀；QP2010型GC－MS分析儀，日本島津公司；TAM（Ⅲ）型微量量熱儀，美國TA 儀器公司；PHS－3C型pH 計，上海雷磁公司。

1.2 產出水的理化性質測定

分別取3口油井的產出水150mL，過0.22μm 濾膜，取濾液進行理化性質測定。產出水的pH 值用pH計測定；產出水中Na＋、Ca2＋、Mg2＋的含量用原子吸收儀測定；總有機碳（TOC）和總氮（TN）的含量用總有機碳分析儀測定；總磷（TP）的含量用鉬酸銨法測定。

1.3 產出水中微生物的代謝熱測定

采用微量量熱法測定：設定微量量熱儀溫度為28 ℃。在無菌操作條件下向安瓿瓶中加入2 mL LB液體培養基和10μL產出水，密封，放入微量量熱儀中測定代謝熱，以時間為橫坐標、產熱功率為縱坐標繪制新陳代謝曲線。

在微生物的指數生長期，產熱功率Pt與生長速率常數k之間有公式：

式中：P0、Pt分別為指數生長期初始和t時刻的產熱功率。根據式（1）進行線性擬合，即可得到生長速率常數k，該常數是反映微生物繁殖速度的重要指標。

1.4 產出水中微生物對正構烷烴的降解實驗

分別以十二烷、十六烷、原油為碳源，對3口油井產出水中微生物降解烷烴的能力進行研究。原油添加量為0.1%（質量濃度），十二烷、十六烷添加量為0.2%（體積分數）。依次添加1%的葡萄糖培養基對產出水進行活化，待OD600值為0.5左右時進行接種，接種量為2%，然后密封瓶塞減少烷烴的揮發。以不加菌液作為空白對照組，培養振蕩條件為30 ℃、160r·min－1。

1.5 降解率測定

分別測定烷烴在第5d、第10d的降解率和原油在第10d的降解率。取10mL 正己烷與50mL菌液充分混合，靜置10min后分別收集上層有機相和下層水相。重復此操作2次，合并有機相，棄下層水相。將有機相過無水硫酸鈉柱除去水分，蒸發濃縮至2mL，進行GC－MS分析，按式（2）計算降解率（ω）：

式中：c0為空白烷烴的質量濃度，通過內標與正構烷烴的峰面積比值計算；c1為培養液中殘留的烷烴質量濃度。

GC－MS條件：進樣口無分流模式，溫度300 ℃；Rtx－5MS型彈性石英毛細管色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25μm）；載氣（氦氣）流速為1.2 mL·min－1；爐溫60 ℃保持1min，以15 ℃·min－1升到150 ℃，再以6 ℃·min－1升到320 ℃保持10min。

2 結果與討論

2.1 產出水的理化性質（表1）

從表1可以看出：3口油井產出水為中性或微偏堿性，pH 值差異不大；3口油井產出水中的總有機碳含量相近；1032－4井產出水中的總氮含量最高，達到8.54mg·L－1；1050－2井產出水中的總磷含量最低，僅為0.33mg·L－1；由于油藏為高礦化環境，對應的金屬離子含量普遍較高，其中Na＋的含量最高，均在1 000mg·L－1左右。

表1 產出水的理化性質／（mg·L－1）Tab.1 The physical and chemical properties of produced water／（mg·L－1）

2.2 產出水的能量代謝

用微量量熱儀測得的產出水中微生物的新陳代謝曲線如圖1所示，部分微量熱參數見表2。

圖1 產出水中微生物的新陳代謝曲線Fig.1 The metabolism curves of microorganism in different produced water

表2 產出水的微量熱參數Tab .2 The microcalorimetric parameters of produced water

由圖1和表2可看出：1032－4井產出水總產熱量、最大產熱功率均最低，在125h之前微生物幾乎沒有生長，125h之后開始迅速生長，在138h達到最大產熱功率（圖1c）；1050－2井產出水總產熱量較高，培養18h后達到最大產熱功率429.40μW，微生物代謝活躍，之后隨著氧氣和營養物質的耗竭，菌體逐漸死亡（圖1a）；1032－1井產出水總產熱量最高，但是生長速率常數較小，在測量期間生長較平緩，生長周期長（圖1b）。由此可知，3口油井產出水中的微生物在能量代謝方面存在較大差異，說明產出水中的微生物數量及種類存在差異。

另外，1050－2井產出水中微生物的生長速率常數最大，1032－4井次之，1032－1井最小（表2）。1050－2井微生物的出峰時間最早，1032－4井的出峰時間相對較晚（圖1），可能是由于代謝過程后期厭氧微生物被激活，整體活性升高。

2.3 正構烷烴的降解實驗

2.3.1 正構烷烴的降解效果

分別以十二烷、十六烷為碳源，考察3口油井產出水中的微生物對其降解效果，烷烴在第5d、第10d的降解率見圖2。

圖2 正構烷烴在第5d、第10d的降解率Fig.2 The degradation rate of n－alkanes after incubation for 5dor 10d

由圖2可看出：3口油井產出水中的微生物均能較好地降解烷烴；其中，1050－2 井產出水在以十六烷為唯一碳源的培養基中經過短暫的適應期，菌群迅速生長，培養液很快呈現渾濁，經過5d的培養，十六烷降解率達到80%，第10d降解率高達96.65%，且對十二烷的降解效果更好，10d的降解率達到98.67%；1032－4井產出水中的微生物對十六烷、十二烷的降解能力相對最小，10d的降解率均為85%左右。

2.3.2 原油的降解效果

以原油為碳源，考察3口油井產出水的微生物對其降解效果，降解產物（m／z＝85）的離子色譜見圖3。

圖3 降解產物（m／z＝85）的離子色譜Fig.3 Ion chromatograms of the degradation products（m／z＝85）

選取不易被生物降解的藿烷（m／z＝191）作為生物標志物對原油中烷烴在第10d的降解情況進行分析［10］，結果見圖4。

圖4 原油中正構烷烴在第10d的降解率Fig.4 The degradation rate of n－alkanes in crude oil after incubation for 10d

由圖4可看出：3口油井產出水中微生物對原油的平均降解率分別為74.35%、77.45%、81.07%；不僅對短鏈烷烴具有很好的降解效果，對C20以上的烷烴依然具有60%以上的降解率；3口油井產出水中微生物為混合菌群，擁有能夠降解各種鏈長烷烴的優勢菌株，因此其對烷烴的利用不局限于專一鏈長的烷烴；而單菌只能利用特定的底物，不能實現對其它烷烴的降解。與之前降解指定烷烴（十二烷和十六烷）的結果相似，1050－2井產出水中微生物對原油中烷烴的降解能力最強，1032－4井的最弱。

2.4 相關性分析

為研究3口油井產出水中微生物對正構烷烴降解率的影響，分析了各因素之間的相關性，如表3所示。

表3 各因素之間的相關性分析Tab.3 The correlation analysis among different parameters

由表3可知：（1）產出水能量代謝與降解率之間存在顯著的正相關，代謝活躍的微生物對烷烴的降解率最大，特別是最大產熱功率，相關性系數均達到0.96以上，表明代謝活性高的樣品更能有效地利用烷烴［11］；（2）TOC、TN、TP的含量與降解率呈負相關，表明產出水中高有機質含量抑制了微生物的活性；（3）Na＋、Ca2＋、Mg2＋的濃度與降解率均呈正相關，表明當前離子濃度沒有對產出水中微生物產生明顯的抑制作用，說明現有的油藏條件適合培養高效的烷烴降解菌株，有利于現場的微生物修復技術的開展。

3 結論

對大港油田3口油井產出水中的微生物進行能量代謝研究，結果表明，1050－2井產出水中微生物的產熱功率最高，為429.40μW，生長速率常數最大，為0.49h－1。1050－2井產出水中微生物對十二烷、十六烷的10d降解率分別達到98.67%、96.65%，對原油中烷烴的降解效果也高于其它產出水，其中對C12～C35的正構烷烴降解率可達81.07%。相關性分析證實了代謝活性高的微生物能有效降解烷烴，同時也發現高有機質的環境不利于降解烷烴的微生物的生存。

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