碳氮源及pH調控對假腸膜明串珠菌產甘露醇的影響

朱婧，吳昊，任心怡，張敏，馬江鋒，姜岷

（南京工業大學生物與制藥工程學院，材料化學工程國家重點實驗室，江蘇 南京 211816）

碳氮源及pH調控對假腸膜明串珠菌產甘露醇的影響

朱婧，吳昊，任心怡，張敏，馬江鋒，姜岷

（南京工業大學生物與制藥工程學院，材料化學工程國家重點實驗室，江蘇 南京 211816）

為了降低生物法制備甘露醇的成本，以假腸膜明串珠菌Leuconostoc pseudomesenteroides G123為研究對象，對培養基中的氮源、葡萄糖與果糖比例和pH調控過程進行了優化，提高了果糖轉化率和甘露醇產量。5L發酵罐中結果顯示：采用2g/L的酵母粉作為單一氮源，葡萄糖和果糖的比例為0.35∶1，初始pH值7.5，發酵過程中保持pH值不低于4.5，甘露醇產量可達57.24g/L，甘露醇對果糖的轉化率為83.2%。該過程副產D-乳酸20.32g/L，其光學純度達99.9%，具有回收價值，甘露醇與D-乳酸對糖總轉化率為89.38%，有助于降低生物法制備甘露醇的成本。

甘露醇；氮源；pH調控；D-乳酸

甘露醇是六碳糖醇化合物，廣泛應用于食品、制藥、醫藥和化學品等領域[1-2]。甘露醇的甜度只有蔗糖的一半[2]。相比其他糖類，如蔗糖、乳糖、葡萄糖和果糖，甘露醇具有低熱量的優點[3]，同時甘露醇在代謝過程中不需要胰島素的參與，是糖尿病人食品甜味劑的最佳替代品。目前，工業上生產甘露醇主要通過化學法，在高溫高壓條件下以鎳作為催化劑催化葡萄糖和果糖（1∶1）的混合物和氫氣來合成。催化合成的化合物中甘露醇只占總量的25%，其余75%都是副產物山梨醇，而將甘露醇與副產物分離的過程中會產生較高的成本和更低的收率[1，3]。Mochihiro等[4]指出，在此工藝過程中結晶甘露醇的收率只有初糖的17%。微生物法合成甘露醇具有綠色清潔、反應條件溫和、沒有山梨醇生成等優點而得到廣泛關注。

異型乳酸菌是生產甘露醇的良好菌株，如乳酸桿菌屬、明串珠菌屬和酒球菌屬[5]。這些菌株可利用甘露醇脫氫酶（mannitol 2-dehydrogenase，MDH）將果糖還原為甘露醇，同時生成副產物乳酸、乙酸、CO2和乙醇，而且這些副產物很容易就能跟甘露醇分開。當異型乳酸菌在厭氧條件下以葡萄糖和果糖（0.5∶1）的混合糖為碳源時，菌株會以葡萄糖作為主代謝碳源，同時產生NAD(P)H和ATP，而果糖會消耗NAD(P)H并還原為甘露醇[5]。值得一提的是，明串珠菌屬在生產甘露醇時，副產物中的乳酸往往是 D-型結構[6]，D-乳酸作為一個手性中心，是多種手性物質的前體，廣泛應用于醫藥、高效低毒農藥除草劑及化妝品等領域的手性合成[7]，目前90%含量的D-乳酸市場售價達到4萬元/噸，具有較高的附加值。

目前異型乳酸菌生產甘露醇對碳氮源的需求較高，Yun等[8]研究了Leuconostoc sp. Y-002代謝各種不同碳源發酵產甘露醇的結果，發現只有加入果糖和蔗糖時才能產甘露醇，在加入10g/L酵母粉的情況下，以50g/L果糖發酵25h得到20g/L甘露醇。Soetaert等[1]以150g/L果糖和75g/L葡萄糖作為碳源分批發酵Leuconostoc pseudomesenteroides ATCC12291，60h后果糖轉化率為90%，但需要加入10g/L胰蛋白胨和10g/L酵母粉作為氮源。Kim等[9]研究了L.pseudomesenteroides NRRL B-1149在不同果糖濃度下分批和補料分批對產甘露醇的影響，分批發酵加入50g/L果糖產率最高，得39g/L甘露醇，通過補料分批發酵對果糖（200g/L）的轉化率可達 89.5%，但仍然需要添加 5g/L酵母粉和5g/L蛋白胨。pH值是影響甘露醇合成的另一因素，菌體在代謝糖時會產生大量乳酸，使pH值不斷下降，影響了發酵后期菌體的生長和代謝，Saha等[10]控制發酵pH值恒定在5.0，Yue等[11]采用了兩階段控制pH值，先控制pH值在5.5，利于菌體的生長，再控制pH值在4.5，利于甘露醇的合成。本文對假腸膜明串珠菌L.pseudomesenteroides G123發酵制備甘露醇的碳氮源和pH調控進行了初步優化研究。

1 實驗材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

Leuconostoc pseudomesenteroides G123由本實驗室自主篩選誘變得到，中國典型培養物保藏中心（武漢大學）CCTCC2014115。

1.1.2 培養基

種子培養采用MRS培養基（g/L）：果糖20，蛋白胨10，酵母粉5，牛肉膏5，CH3COONa 5，C6H5O7(NH4)32，K2HPO4·3H2O 2，MgSO4·7H2O 0.2，MnSO4·H2O 0.05，吐溫80，pH值自然，121℃滅菌15min。

發酵培養基（g/L）：總糖濃度90，有機氮源1～5，K2HPO4·3H2O 26，MgSO4·7H2O 0.2，MnSO4·H2O 0.01，FeCl3·H2O 0.01，CaCl20.02，NaCl 0.01，初始pH值 6.0～7.5，121℃滅菌15min。

1.2 方法

1.2.1 培養條件

種子液培養條件：將保存于?80℃的菌株，接入到裝液量為5mL的種子培養基試管中，接種量1%[12]，于30℃、200r/min搖床中培養12～14h，作為一級種子液。再將一級種子液轉接到 500mL三角瓶中，裝液量為 120mL，接種量 1%，于 30℃、200r/min培養8～10h，作為二級種子液。

血清瓶培養條件：100mL血清瓶裝液量30mL發酵培養基，接種量6%，通入無菌過濾的N22min，200r/min培養36h。

5L發酵罐（KF-5Lfermentor;KoBio Tech. Co. Ltd.）培養條件：裝液量為 2L發酵培養基，接種量6%，于30℃、攪拌轉速150r/min、全程通N2保持厭氧環境至菌株停止消耗葡萄糖，初始pH值為7.5，待其降低至某一pH值（4.5～5.5）時，以20%NaOH維持該pH值至發酵結束。定時取樣測定菌體密度（OD600）和葡萄糖濃度，離心保存上清液，檢測試樣中的甘露醇、果糖、乳酸。

1.2.2 分析方法

菌體密度的測定：用紫外分光光度計（Spectrumlab 752S）在 600nm 處測定吸光值OD600。

葡萄糖濃度的測定：用生物傳感分析儀（SBA 240C，山東省科學院生物研究所）測定。

果糖和甘露醇濃度的測定：色譜柱為 Benson BP-100 Pb++，以純水作為流動相，流速0.4mL/min，柱溫80℃，用示差折光檢測器檢測。

乳酸濃度的測定：色譜柱為 Aminex HPX-87H[13]，以5mmol/L H2SO4作為流動相，流速0.6mL/min，柱溫55℃，用紫外檢測器檢測，檢測波長為215nm[14]。

D-乳酸光學純度的測定：用高效液相色譜法進行測定[15]。

2 結果與討論

2.1 培養基的初始pH值對發酵性能的影響

MRS培養基的自然pH值在7.0左右，假腸膜明串珠菌具有一定的產酸能力，初始需要微堿性環境[16]，降低氮源總量時，不可避免地會改變培養基的自然pH值條件，本實驗考察了培養基初始pH值 6.0～8.0對發酵性能的影響，初始總糖濃度90g/L（葡萄糖和果糖比例為0.5∶1），培養基其余成分同種子培養基，30℃，血清瓶厭氧培養24h，發酵結果如圖1所示。

由圖1可知，菌體生長性能（DCW為細胞干重）與甘露醇產量隨著培養基初始pH值升高逐漸提升，當初始pH值為7.5時，甘露醇產量最高，達到 44.09g/L，但在發酵終止后，不同條件下的pH值均維持在4.0左右（數據未給出）。故確定血清瓶培養時，培養基初始pH值為7.5。

2.2 氮源種類及用量對發酵性能的影響

種子培養基含有酵母膏、蛋白胨和牛肉膏等豐富昂貴的氮源，為了降低氮源成本，首先考察了不同氮源組合對發酵性能的影響，總氮源為5g/L，分別添加5g/L蛋白胨，5g/L酵母粉，2.5g/L蛋白胨加2.5g/L酵母粉，培養基其余成分同發酵培養基，并與對照的MRS培養基作比較，在總糖濃度為90g/L，葡萄糖和果糖的比例為 0.5∶1，初始 pH值為 7.5條件下血清瓶30℃厭氧培養36h，結果如圖2所示。

圖2 不同氮源組合對發酵結果的影響

由圖2可知，當用5g/L酵母粉作為單一氮源時，甘露醇濃度最高，為46.40g/L，甚至優于對照MRS培養基。而單一使用或部分使用蛋白胨作為氮源時，甘露醇產量均明顯低于酵母粉，這可能是由于蛋白胨中沒有足夠的氨基酸和維生素。因此選擇酵母粉作為唯一氮源開展進一步優化。

為了進一步降低氮源用量，分別考察了不同酵母粉添加量（1～5g/L）對發酵產甘露醇的影響，結果如圖3所示。

由圖3可知，隨著酵母粉用量的減少，生物量明顯下降，但當酵母粉用量＞1g/L時，甘露醇和D-乳酸的產量變化不顯著，其中加入2g/L酵母粉得到的甘露醇為40.49g/L，比加入5g/L酵母粉時僅減少了0.94%，說明在一定底物濃度范圍內，酵母粉用量減少雖然不利于菌體的生長，但對甘露醇的產量影響不大。因此將氮源添加量優化為2g/L酵母粉，比MRS培養基減少了90%的有機氮源用量。

圖3 不同酵母粉添加量對發酵結果的影響

2.3 碳源中葡萄糖和果糖的比例對發酵性能的影響

本實驗考察了不同葡萄糖和果糖比例對發酵性能的影響，在初糖濃度 90g/L，葡萄糖和果糖比例分別為1∶1、0.5∶1、0.35∶1和0.25∶1，培養基氮源為2g/L酵母粉，其余成分同發酵培養基，初始pH值為7.5，血清瓶30℃厭氧培養36h，發酵結果如表1所示。

表1 不同比例的葡萄糖和果糖以及純果糖對發酵結果的影響

由表1可知，葡萄糖和果糖的比例為0.35∶1時，甘露醇產量最高，達41.06g/L，其對果糖的轉化率也最高，達到 88.82%，對總糖的轉化率為66.11%。而葡萄糖含量較高時，均有大量葡萄糖殘留。在厭氧發酵混合糖時，明串珠菌可以同時消耗葡萄糖和果糖，假腸膜明串珠菌主要利用葡萄糖作為產酸和產輔酶途徑，但由于明串珠菌消耗果糖的速度比葡萄糖快[17]，菌體會將部分果糖轉化為6-P-葡萄糖用于獲取能量，并產生NADH用于合成甘露醇。所以果糖比例過高反而會降低甘露醇的轉化率。上述結果表明在總糖濃度一致的情況下，合適的葡萄糖和果糖比例會提高甘露醇對果糖的轉化率，本文確定培養基中葡萄糖和果糖的比例為0.35∶1。

2.4 不同pH調控策略對發酵結果的影響

血清瓶發酵結果表明，假腸膜明串珠菌發酵終止時的pH值在4.0左右，過低的pH值會抑制菌體的耗糖和生長[18]。有報道表明，合理的pH調控可以有效地提高菌體的耗糖和甘露醇產量[5]。通過上罐發酵，分別將pH值控制在4.5、5.0和5.5（總糖濃度為90g/L），結果如圖4～圖7所示。

圖4 pH調控對假腸膜明串珠菌G123生長的影響

圖5 pH調控對假腸膜明串珠菌G123消耗葡萄糖的影響

圖6 pH調控對假腸膜明串珠菌G123消耗果糖的影響

圖7 pH調控對假腸膜明串珠菌G123產甘露醇和乳酸的影響

如圖4所示，菌體在0～24h處于對數期，此時的耗糖和產甘露醇速率較快，但甘露醇對果糖的轉化率均低于靜止期（表 2），說明有部分果糖轉化為6-P-葡萄糖，進入PK途徑，尤其是pH值5.5時，甘露醇對果糖的轉化率僅75.1%。菌體在靜止期中的耗糖和產甘露醇速率明顯降低，但靜止期所產的甘露醇占甘露醇總產量的 22.1%～29.7%，說明甘露醇的生成屬于部分生長相關型。pH值控制在5.0和5.5時，發酵至48h，果糖均已消耗完（圖6），而pH值4.5時，發酵在52h終止，甘露醇產量達57.24g/L，分別比pH值控制在5.0和5.5提高了1.03倍和1.06倍。可見高pH值環境有利于菌體消耗底物，而甘露醇適合在低pH值環境下合成。由此可見：發酵pH值控制在4.5時產甘露醇較好，甘露醇對果糖的轉化率為 83.2%，產乳酸20.32g/L，經檢測不含L-乳酸，D-乳酸光學純度達99.9%，甘露醇和 D-乳酸對總糖的轉化率為89.38%。

表2 pH調控在對數期和靜止期對假腸膜明串珠菌G123產甘露醇和乳酸的影響

3 結 論

通過考察假腸膜明串珠菌G123生產甘露醇的性能及對碳氮源的優化，有效地減少了培養基有機氮源用量，保證了甘露醇對果糖的轉化率，并通過對pH調控過程的優化，提高了碳源的利用率與甘露醇產量。結果表明：在5L發酵罐中，采用2g/L的酵母粉作為單一氮源，總糖濃度90g/L，葡萄糖和果糖的比例為0.35∶1，初始pH值7.5，發酵過程中控制pH值不低于4.5，發酵52h，甘露醇產量達到57.24g/L，甘露醇對果糖的轉化率為83.2%，并副產 D-乳酸 20.32g/L，D-乳酸光學純度達99.9%，具有回收價值，甘露醇和D-乳酸對總糖的轉化率為89.38%，有助于降低甘露醇的生產成本。

[1]Soetaert W，Vanhooren P T，Vandamme E J. The production of mannitol by fermentation[J]. Carbohydrate biotechnology protocols，1999，10：261-275.

[2]Von Weymarn N，Hujanen M，Leisola M. Production of D-mannitol by heterofermentative lactic acid bacteria[J]. Process Biochemistry，2002，37：1207-1213.

[3]Von Weymarn N，Kiviharju K，Leisola M. High-level production of D-mannitol with membrane cell-recycle bioreactor[J]. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology，2002，29：44-49.

[4]Iijima M，Mochihiro T，Osada Y，et al. Process for preparing D-mannitol：US，19760749623[P]. 1978-04-11.

[5]Saha B C，Nakamura L K. Production of mannitol and lactic acid by fermentation with Lactobacillus intermedius NRRL B-3693[J]. Biotechnology and Bioengineering，2003，82：864-871.

[6]Soetaert W，Buchholz K，Vandamme E. Production of D-mannitol and D-lactic acid by fermentation by Leuconostoc mesenteroides[J]. Agro Food Industry Hi-Tech，1995，6（1）：41-44.

[7]Tokiwa Y，Calabia B P. Biodegradability and biodegradation of poly (lactide)[J]. Applied Microbiology and Biotechnology，2006，72：244-251.

[8]Yun J W，Kim D H. A comparative study of mannitol production by two lactic acid bacteria[J]. Journal of Fermentation and Bioengineering，1998，85（2）：203-208.

[9]Kim C Y，Lee J H，Kim B H，et al. Production of mannitol using Leuconostoc mesenteroides NRRL B-1149[J]. Biotechnology and Bioprocess Engineering，2002，7（4）：234-236.

[10]Saha B C，Racine F M. Effects of pH and corn steep liquor variability on mannitol production by Lactobacillus intermedius NRRL B-3693[J]. Applied Microbiology and Biotechnology，2010，87：553-60.

[11]Yue M，Cao H，Zhang J，et al. Improvement of mannitol production by Lactobacillus brevis mutant 3-A5 based on dual-stage pH control and fed-batch fermentations[J]. World Journal of Microbiology & Biotechnology，2013，29：1923-30.

[12]梅佳軍，張常青，劉嶸明，等. 利用改性載體固定化大腸桿菌產琥珀酸[J]. 化工進展，2013，32（1）：161-165.

[13]徐蓉，奚永蘭，張九花，等. 利用纖維素水解液中的纖維二糖發酵制備丁二酸[J]. 化工進展，2013，32（4）：874-877.

[14]Saha B C. A low-cost medium for mannitol production by Lactobacillus intermedius NRRL B-3693[J]. Applied Microbiology And Biotechnology，2006，72：676-80.

[15]丁子建，柏中中，孫志浩，等. 芽孢乳桿菌發酵葡萄糖制備D(-)-乳酸的研究[J]. 生物加工過程，2004，2（3）：30-36.

[16]楊曉暉，籍保平，李博，等. 泡菜中優良乳酸菌的分離鑒定及其發酵性能的研究[J]. 食品科學，2005，26：130-134.

[17]Carvalheiro F，Moniz P，Duarte L C，et al. Mannitol production by lactic acid bacteria grown in supplemented carob syrup[J]. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology，2011，38：221-227.

[18]金紅星，史建波，成文玉，等. 以蔗糖為原料明串珠菌發酵生產甘露醇[J]. 食品與發酵工業，2011，37（2）：91-93.

Effect of carbon and nitrogen source and pH control strategy on mannitol production by Leuconostoc pseudomesenteroides G123

ZHU Jing，WU Hao，REN Xinyi，ZHANG Min，MA Jiangfeng，JIANG Min
（State Key Laboratory of Materials-Oriented Chemical Engineering，College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering，Nanjing Tech University，Nanjing 211816，Jiangsu，China）

A new mutant strain Leuconostoc pseudomesenteroides G123 was investigated in this study. The nitrogen source，the ratio of glucose and fructose and the pH control strategy were optimized to reduce the cost of mannitol production. Batch fermentations were operated in a 5L fermentor.The results showed that 57.24g/L mannitol was produced with the mannitol yield of 83.2% when 2g/L yeast extract was chosen as the single nitrogen source，the ratio of fructose toglucose was 0.35∶1，and the initial pH was controlled at 7.5 and kept constant at 4.5 in the later phase. Besides，20.32g/L D-lactic acid with optical purity of 99.9% was also produced which suggested it could be recovered as a by-product. The yield of mannitol and lactic acid to the total sugar was 89.38%. As a result，the cost was reduced efficiently.

mannitol; nitrogen source; pH control strategy; D-lactic acid

TQ 923

A

1000-6613（2015）12-4333-05

10.16085/j.issn.1000-6613.2015.12.033

2015-03-13；修改稿日期：2015-04-25。

江蘇高校優勢學科建設工程項目（PAPD）及新世紀優秀人才支持計劃（NCET-12-0732）項目。

朱婧（1990—），女，碩士研究生。聯系人：姜岷，教授。E-mail bioengine@njtech.edu.cn。