PCI術后患者CYP2C19基因多態性與氯吡格雷抵抗關聯性研究

彭文星，徐曉宇，石秀錦，林 陽

（1.首都醫科大學化學生物學與藥學院臨床藥學系，北京 100069；2.首都醫科大學附屬北京安貞醫院藥事部，北京 100029）

·臨床評價·

PCI術后患者CYP2C19基因多態性與氯吡格雷抵抗關聯性研究

彭文星1,2，徐曉宇1,2，石秀錦2，林 陽2

（1.首都醫科大學化學生物學與藥學院臨床藥學系，北京 100069；2.首都醫科大學附屬北京安貞醫院藥事部，北京 100029）

目的：探討PCI術后患者CYP2C19基因多態性與氯吡格雷抵抗的關聯性。方法：回顧性篩選2006年3月 – 2015年4月444例診斷為急性冠脈綜合征（ACS）并進行PCI治療的患者，以ADP誘導的血小板聚集率＞ 46%定義為氯吡格雷抵抗，血小板聚集率≤46%定義為氯吡格雷敏感，分析兩組之間基因型的差異，并比較不同基因型發生氯吡格雷抵抗的危險度。結果：CYP2C19*2、*3突變雜合子的氯吡格雷抵抗風險顯著高于野生型*1/*1。兩組患者中CYP2C19*2/*2、*2/*3發生氯吡格雷抵抗的風險更高。相對于*1/*1基因型，*1/*2、*2/*2和*2/*3具有更高的血小板聚集率。結論：急性冠脈綜合征患者CYP2C19*2、*3突變與氯吡格雷抵抗相關，隨著CYP2C19*2、*3的突變基因位點數量增加血小板聚集率也逐漸增加。

氯吡格雷；基因多態性；CYP2C19；急性冠脈綜合征

急性冠脈綜合征（acute coronary syndrome，ACS）是危害中國人群健康的一種常見疾病。冠狀動脈介入術（percutaneous coronary intervention，PCI）是治療ACS的方法之一。阿司匹林和氯吡格雷雙抗治療已成為PCI術后預防支架血栓、腦中風等缺血性心腦血管事件的常規方案。由于個體差異，約4% ～30%的患者服用常規劑量的氯吡格雷達不到預期的抗血小板療效[1]。氯吡格雷是一種前體藥物，需經過兩步代謝生成活性代謝產物，其中細胞色素P450（CYP）2C19參與了氯吡格雷的兩次代謝[2]。最近相關研究發現編碼CYP2C19酶的基因位點多態性與氯吡格雷抵抗有關，若該位點突變為失功能等位基因可使氯吡格雷的療效降低，并增加患者心血管事件的發生率[3-6]。本研究分析CYP2C19基因突變與氯吡格雷抵抗的相關性，進一步探索氯吡格雷抵抗的遺傳因素，為臨床制定合理的抗血小板方案提供理論依據。

1 方法

1.1 研究人群

回顧性收集2006年3月 – 2015年4月入院并進行基因檢測的3078例患者，最終共篩選出444例患者。納入標準：服用標準劑量阿司匹林100 mg·d-1和氯吡格雷75 mg·d-1抗血小板治療，持續至少3 d，用藥3 d后進行血小板聚集率檢查，已完成CYP2C19*2和*3基因檢測。排除標準：慢性肝病病史，嚴重腎功能不全（Cr ＜ 30 mL·min-1），合并出血性疾病，有阿司匹林或氯吡格雷的禁忌證，只使用單抗治療，血小板計數小于100×109·L-1，合并使用華法林，同時使用西洛他唑或替格瑞洛等新型抗血小板藥物。

1.2 血小板聚集率

用枸櫞酸抗凝管采血3 ～ 5 mL，用比濁法進行血小板功能檢測，先將試管在4000 ～ 5000 r·min-1離心5 min，得到富含血小板的血漿（PRP），再于22 500 r·min-1高速離心15 min獲得含少量血小板的血漿（PPP），將PPP加入PRP中，將血小板濃度稀釋至2×105·μL-1，加入6 μmol·L-1的ADP誘導血小板聚集，之后測定血小板聚集率，儀器采用Chrono-Log Lume-Aggregometer（model 700，美國）。

1.3 基因位點測定

用EDTA（乙二胺四乙酸）抗凝管采血2 ～ 3 mL，采用熒光染色原位雜交檢測法。取150 μL血加入1 mL紅細胞裂解液，靜置5 min后，在3000 r·min-1離心5 min，棄上清，再加入核酸純化試劑（北京華夏時代基因科技發展有限公司），混勻后加入相應的測序反應通用試劑（北京華夏時代基因科技發展有限公司），采用雙通道實時熒光定量PCR儀（TL988A，西安天隆科技有限公司）進行檢測。

1.4 氯吡格雷抵抗定義

我們將ADP誘導的血小板聚集率＞ 46%定義為氯吡格雷抵抗，以ADP誘導的血小板聚集率≤46%定義為氯吡格雷敏感。這個臨界點的選擇來自于之前的研究結果，ADP誘導的血小板聚集率＞ 46%的患者兩年內缺血性心血管事件的發生率顯著大于對照組[7]。有研究將血小板聚集率＞ 70%（ADP為20 μmol·L-1）定義為抵抗，也有研究將血小板聚集率最高的25%人群定義為抵抗[8-10]。從臨床實用性和本研究的實驗方法考慮，我們將臨界點設定為46%。

1.5 統計學分析

采用SPSS17.0對數據進行統計學分析。正態性連續性變量采用（均值±標準差）表示，非正態性資料采用中位數和四分位數表示，計數資料用百分比表示。正態性連續性變量采用雙側t檢驗比較兩組之間的差異，計量資料采用卡方檢驗或者Fisher精確檢驗。基因型的比較采用單因素ANOVA分析，兩組之間基因型或者位點的比較采用卡方檢驗，以P ＜ 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 研究人群的基線水平

根據納入排除標準，最終共納入444例診斷為ACS并行PCI的患者，依據ADP誘導的血小板聚集率分組，氯吡格雷抵抗組共254例（57.2%），敏感組共190例（42.8%）。444例患者的平均年齡為（59.39 ±9.77）歲（范圍32 ～ 83歲）。其中肌酐、尿酸、空腹血糖、甘油三酯、高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL）、白細胞、血小板結果不符合正態分布，采用中位數和四分位數來表示離散程度。結果顯示兩組人群一般情況均無顯著性差異，表明患者的年齡、支架數量與長度、病變血管數量與合并用藥等均不是引起氯吡格雷抵抗的危險因素，詳見表1。所有患者ADP誘導的血小板聚集率為（48.85±17.52）%，且符合正態性分布。

2.2 CYP2C19*2、*3的基因分布與氯吡格雷抵抗的關聯性

分別分析兩組間CYP2C19*2、*3的每種基因類型分布，詳見表2。氯吡格雷突變雜合子*1/*2和*1/*3發生抵抗的危險度分別是*1/*1的2.15倍[95%CI（1.39，3.33），P = 0.001]和2.24倍[95%CI（1.01，4.94），P = 0.043]，而突變純合子*2/*2和*2/*3發生氯吡格雷抵抗的危險度分別高達4.89倍[95%CI（2.44，9.81），P ＜ 0.001]和6.12倍[95%CI（1.68，22.38），P = 0.002]。所有患者中只有3例為*3/*3純合子，均為抵抗組，由于病例較少，尚不能得出統計學差異和相對危險度。

2.3 不同基因型對應的ADP誘導的血小板聚集率

不同基因型ADP誘導的血小板聚集率的差異見表3。CYP2C19*1/*2突變雜合子的血小板聚集率顯著高于*1/*1（P ＜ 0.001），而CYP2C19*1/*3與野生型*1/*1相比沒有表現出顯著性差異（P = 0.055）。而突變純合子（*2/*2、*2/*3和*3/*3）與野生型*1/*1相比均具有顯著性差異，且突變位點數目越多，對應的血小板聚集率越高。

3 討論

3.1 結果分析

氯吡格雷抵抗是有多種因素復合造成的，現已知的因素有基因多態性（CYP2C19、PON1、ABCB1等）、用藥依從性、飲食、吸煙以及藥物相互作用等，基因多態性是其中十分重要且研究較多的危險因素[11]。本研究根據ADP誘導血小板聚集率分為氯吡格雷抵抗組和敏感組。兩組患者的基線水平沒有顯著性差異。

本研究結果顯示CYP2C19單位點突變*1/*2和*1/*3相對于野生型*1/*1顯著增加了氯吡格雷抵抗的風險，兩位點同時突變*2/*2和*2/*3基因型氯吡格雷抵抗的風險度更大，見表2。原因是當CYP2C19突變時，人體代謝氯吡格雷的酶活性降低，進而代謝活性產物降低，無法達到預期的臨床療效，隨著突變位點的增加，酶的活性就越低。中國人群中該基因的突變頻率（約40%）高于非洲人和高加索人（突變率13%）[12]，故應更加重視該基因的突變。本研究不能證明CYP2C19基因突變增加ACS患者的心血管事件發生率，但不同CYP2C19基因型的血小板聚集率有顯著差異，說明基因檢測與血小板功能檢測有很好的一致性。

表1 研究人群的基線信息Tab 1 Baseline characteristics of the study population

本研究發現以野生型*1/*1為基礎，突變為*1/*2時血小板聚集率明顯增加（41.88±17.05 vs 51.17±16.05）。既往研究顯示隨著血小板聚集率的增加，發生缺血性心血管事件的風險增加，故該位點突變是氯吡格雷抵抗的重要原因之一[13-14]。*1/*3基因型相比于*1/*1的血小板聚集率有所增加，但是增加程度尚不具有顯著性差異（48.52±17.05 vs 41.88±17.05，P = 0.055），原因是中國人群中*3位點突變頻率較低，該研究中*1/*3的病例數共31例，病例數較少，該結果仍需要大規模的研究加以驗證。

表2 基因型分布與氯吡格雷抵抗的關聯性Tab 2 The correlation between genotype distribution and clopidogrel resistance

表3 CYP2C19*2、*3與血小板聚集率的關聯性Tab 3 The correlation between CYP2C19*2, *3 and platelet aggregation rate

3.2 實驗方法

本研究采用比濁法進行血小板功能檢測，與先前的研究采用了相似的檢測方法。血小板聚集試驗是一種體外的血小板功能檢測，雖然該方法有一定限制性，如重復性較差和繁瑣的制作樣本流程，但仍是最常用的血小板功能檢驗的方法之一。有研究顯示根據血小板功能檢測調整給藥方案不能改善患者的預后，但這些研究主要入選者為非ACS患者，這類患者主要心血管事件（MACE）風險本身就較低。如TRIGGER-PCI研究僅納入擇期手術的穩定期患者，236例患者中主要終點事件僅有1例[15]。

3.3 相關研究與分析

部分研究沒有得到CYP2C19*2、*3突變基因與MACE發生率的相關性，主要是因為這些研究并沒有嚴格入選接受PCI的患者，而大多數臨床研究，包括meta分析仍證實了CYP2C19*2、*3與氯吡格雷抵抗的顯著相關性[16-19]，本研究也進一步證實基因突變對患者的影響。GRAVITAS研究納入了1028例行PCI的患者，從42個位點中僅篩選出CYP2C19*2與血小板高反應性密切相關，與本研究不同之處是該研究采用VerifyNow進行血小板功能檢測，檢測時間點為術后12 ～ 24 h、30 d以及6個月，研究中由于CYP2C19*3突變頻率較低，該位點沒有得出陽性結論[20]。一項來自中國人群的研究納入了447例PCI術后且進行雙抗治療的患者，在氯吡格雷相關14個基因位點中僅發現CYP2C19*2、*3位點與血小板功能具有顯著相關性，但沒有比較二者的聯合作用[21]。本研究則聯合考慮了CYP2C19*2、*3位點，并進行綜合分析，結果顯示CYP2C19*2、*3突變均與氯吡格雷抵抗相關。相關研究如ARMYDA-PRO研究證實了血小板高反應性與不良心血管事件的關聯性，血小板高反應性的患者30 d心血管事件發生率是對照組的6倍（OR = 6.1；P = 0.033）[22]。Parodi等[23]研究發現在短期和長期隨訪中PCI術后患者血小板高反應性與缺血事件顯著相關（HR = 1.49；P = 0.02）。本研究顯示CYP2C19與血小板高反應有明顯的相關性，提示在CYP2C19突變的人群中發生心血管事件的風險增加。相關研究如Fast-MI研究和ADAPT-DES研究也得出了相似的結論：對于ACS，特別是接受PCI治療的患者中，攜帶CYP2C19突變基因的患者發生心血管事件的風險顯著增加[24-25]。

3.4 局限性

本研究并未獲得患者的預后信息，僅根據血小板聚集率指標反映藥物療效，未獲得藥物的臨床反應性。其次，采用比濁法檢測血小板功能不能獲得良好的重現性，導致結果可能有所偏差。本研究為回顧性分析，每個患者進行血小板功能檢測的時間不完全相同，可能造成實驗室檢測結果的差異。此外，本研究中CYP2C19*3/*3基因型僅有3例，由于例數較少，且3例均為抵抗組，故沒有得到顯著性差異，無法進行危險度分析。

4 小結

本研究揭示了單位點基因檢測是預測患者對血小板反應性的方法之一，在患者進行PCI治療之前進行基因型檢測，可根據患者的基因型選擇適合的治療方案，避免因藥物未起效而發生急性心血管事件，如支架血栓、急性心梗等[26]。且單位點基因檢測相對于其他檢測方法，用時較短，檢測方便，可及時為臨床提供準確的藥物基因信息，并可預測患者的氯吡格雷抵抗風險，為患者選擇合適的抗血小板藥物提供參考依據。

[1] Sugunaraj JP, Palaniswamy C, Selvaraj DR, et al. Clopidogrel resistance[J]. Am J Ther, 2010, 17(2): 210-215.

[2] Turner RM, Pirmohamed M. Cardiovascular pharmacogenomics: expectations and practical benefits[J]. Clin Pharmacol Ther, 2014, 95(3): 281-293.

[3] Arima Y, Hokimoto S, Akasaka T, et al. Comparison of the effect of CYP2C19 polymorphism on clinical outcome between acute coronary syndrome and stable angina[J]. J Cardiol, 2015, 65(6): 494-500.

[4] Hou X, Shi J, Sun H. Gene polymorphism of cytochrome P450 2C19*2 and clopidogrel resistance reflected by platelet function assays: a meta-analysis[J]. Eur J Clin Pharmacol, 2014, 70(9): 1041-1047.

[5] Viviani AC, Briguori C, Roncarati R, et al. Routine assessment of on-clopidogrel platelet reactivity and gene polymorphisms in predicting clinical outcome following drug-eluting stent implantation in patients with stable coronary artery disease[J]. JACC Cardiovasc Interv, 2013, 6(11): 1166-1175.

[6] Marcucci R, Giusti B, Paniccia R, et al. High on-treatment platelet reactivity by ADP and increased risk of MACE in good clopidogrel metabolizers[J]. Platelets, 2012, 23(8): 586-593.

[7] Gurbel PA, Antonino MJ, Bliden KP, et al. Platelet reactivity to adenosine diphosphate and long-term ischemic event occurrence following percutaneous coronary intervention: a potential antiplatelet therapeutic target[J]. Platelets, 2008, 19(8): 595-604.

[8] Cuisset T, Frere C, Quilici J, et al. High post-treatment platelet reactivity is associated with a high incidence of myonecrosis after stenting for non-ST elevation acute coronary syndromes[J]. Thromb Haemost, 2007, 97(2): 282-287.

[9] Gurbel PA, Bliden KP, Samara W, et al. The clopidogrel Resistance and Stent Thrombosis (CREST) study[J]. J Am Coll Cardiol, 2005, 46(10): 1827-1832.

[10] Migliorini A, Valenti R, Marcucci R, et al. High residual platelet reactivity after clopidogrel loading and long-term clinical outcome after drug-eluting stenting for unprotected left main coronary disease[J]. Circulation, 2009, 120(22): 2214-2221.

[11] Frelinger AL 3rd, Bhatt DL, Lee RD, et al. Clopidogrel pharmacokinetics and pharmacodynamics vary widely despite exclusion or control of polymorphisms (CYP2C19, ABCB1, PON1), noncompliance, diet, smoking, co-medications (including proton pump inhibitors), and pre-existent variability in platelet function[J]. J Am Coll Cardiol, 2013, 61(8): 872-879.

[12] Desai NR, Canestaro WJ, Kyrychenko P, et al. Impact of CYP2C19 genetic testing on provider prescribing patterns for antiplatelet therapy after acute coronary syndromes and percutaneous coronary intervention[J]. Circ Cardiovasc Qual Outcomes, 2013, 6(6): 694-699.

[13] Tang N, Yin S, Sun Z, et al. The relationship between onclopidogrel platelet reactivity, genotype, and post-percutaneous coronary intervention outcomes in Chinese patients[J]. Scand J Clin Lab Invest, 2015, 75(3): 223-229.

[14] Jin HY, Yang TH, Kim DI, et al. High post-clopidogrel platelet reactivity assessed by a point-of-care assay predicts longterm clinical outcomes in patients with ST-segment elevation myocardial infarction who underwent primary coronary stenting[J]. Int J Cardiol, 2013, 167(5): 1877-1881.

[15] Trenk D, Stone GW, Gawaz M, et al. A randomized trial of prasugrel versus clopidogrel in patients with high platelet reactivity on clopidogrel after elective percutaneous coronary intervention with implantation of drug-eluting stents: results of the TRIGGER-PCI (Testing Platelet Reactivity in Patients Undergoing Elective Stent Placement on Clopidogrel to Guide Alternative Therapy With Prasugrel) study[J]. J Am Coll Cardiol, 2012, 59(24): 2159-2164.

[16] Paré G, Mehta SR, Yusuf S, et al. Effects of CYP2C19 genotype on outcomes of clopidogrel treatment[J]. N Engl J Med, 2010, 363(18): 1704-1714.

[17] Mega JL, Topol EJ, Sabatine MS. CYP2C19 genotype and cardiovascular events[J]. JAMA, 2012, 307(14): 1482-1485.

[18] Holmes MV, Perel P, Shah T, et al. CYP2C19 genotype, clopidogrel metabolism, platelet function, and cardiovascular events: a systematic review and meta-analysis[J]. JAMA, 2011, 306(24): 2704-2714.

[19] 蔡泓敏，陳琿，趙冠人，等.CYP2C19基因多態性與氯吡格雷抗凝作用的相關性研究[J].中國藥物應用與監測，2013，10（5）：254-257.

[20] Price MJ, Murray SS, Angiolillo DJ, et al. Influence of genetic polymorphisms on the effect of high- and standard-dose clopidogrel after percutaneous coronary intervention: the GIFT (Genotype Information and Functional Testing) study[J]. J Am Coll Cardiol, 2012, 59(22): 1928-1937.

[21] Wu H, Qian J, Xu J, et al. Effects of CYP2C19 variant alleles on postclopidogrel platelet reactivity and clinical outcomes in an actual clinical setting in China[J]. Pharmacogenet Genomics, 2012, 22(12): 887-890.

[22] Patti G, Nusca A, Mangiacapra F, et al. Point-of-care measurement of clopidogrel responsiveness predicts clinical outcome in patients undergoing percutaneous coronary intervention results of the ARMYDA-PRO (Antiplatelet therapy for Reduction of MYocardial Damage during Angioplasty-Platelet Reactivity Predicts Outcome) study[J]. J Am Coll Cardiol, 2008, 52(14): 1128-1133.

[23] Parodi G, Marcucci R, Valenti R, et al. High residual platelet reactivity after clopidogrel loading and long-term cardiovascular events among patients with acute coronary syndromes undergoing PCI[J]. JAMA, 2011, 306(11): 1215-1223.

[24] Simon T, Verstuyft C, Mary-Krause M, et al. Genetic determinants of response to clopidogrel and cardiovascular events[J]. N Engl J Med, 2009, 360(4): 363-375.

[25] Stone GW, Witzenbichler B, Weisz G, et al. Platelet reactivity and clinical outcomes after coronary artery implantation of drugeluting stents (ADAPT-DES): a prospective multicentre registry study[J]. Lancet, 2013, 382(9892): 614-623.

[26] Angiolillo DJ, Fernandez-Ortiz A, Bernardo E, et al. Variability in individual responsiveness to clopidogrel: clinical implications, management, and future perspectives[J]. J Am Coll Cardiol, 2007, 49(14): 1505-1516.

Correlation study between CYP2C19 gene polymorphisms and clopidogrel resistance in PCI postoperative patients

PENG Wen-xing1,2, XU Xiao-yu1,2, SHI Xiu-jin2, LIN Yang2
(1. Clinical Pharmacology, School of Chemical Biology and Pharmaceutical Science, Capital Medical University, Beijing 100069, China; 2. Department of Pharmacy, Beijing Anzhen Hospital, Beijing 100029, China)

Objective:To explore the relationship between clopidogrel resistance and CYP2C19 gene polymorphisms.Methods:A total of 444 cases diagnosed as acute coronary syndrome (ACS) and treated with PCI were retrospectively selected from March 2006 to April 2015. The platelet aggregation rate induced by ADP more than 46% was defined as the clopidogrel resistance, and platelet aggregation rate of 46% or less was defined as sensitive to clopidogrel. Comparison of genotype differences between two groups and risk of clopidogrel resistance among different genotypes were analyzed.Results:CYP2C19*2 or *3 heterozygote mutations in ACS patients were associated with a significant increase the risk of clopidogrel resistance compared with CYP2C19*1/*1. CYP2C19*2/*2 and *2/*3 were at higher risk of clopidogrel resistance. Platelet aggregation rates of *1/*2、*2/*2 and *2/*3 were significantly higher than that of *1/*1 genotype.Conclusion:CYP2C19*2 or *3 mutations were associated with clopidogrel resistance in ACS patients. The rate of platelet aggregation increased with the increase of the number of mutant gene loci of CYP2C19*2 and *3.

Clopidogrel; Gene polymorphism; CYP2C19; Acute coronary syndrome

R972

A

1672 – 8157(2015)06 – 0334 – 05

2015-08-01

2015-09-30）

“重大新藥創制”科技重大專項課題 （2012ZX09303016-016）

林陽，女，主任藥師，主要從事醫院藥事管理和藥物臨床研究工作。E-mail：linyang3623@163.com

彭文星，女，在讀碩士研究生，主要從事臨床藥物治療和個體化用藥工作。E-mail：shouyipwx@163.com