HPLC法測定人血漿中紫杉醇的濃度

張 楊，余俊先

（首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院藥劑科，北京 100050）

·實(shí)驗(yàn)研究·

HPLC法測定人血漿中紫杉醇的濃度

張 楊，余俊先

（首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院藥劑科，北京 100050）

目的：建立測定血漿中紫杉醇含量的分析方法。方法：采用高效液相色譜法，色譜柱為Phenomenex C18反相色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm )，炔諾酮為內(nèi)標(biāo)，流動(dòng)相為甲醇∶乙腈∶水 = 40∶30∶30，流速1.0 mL·min-1，檢測波長為227 nm，柱溫40 ℃。結(jié)果：主峰與雜質(zhì)峰完全分離，紫杉醇和內(nèi)標(biāo)物炔諾酮的保留時(shí)間分別為11.4 min和7.8 min。紫杉醇在0.1 ～ 100.0 μg·mL-1的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r = 0.999 9）；其低、中、高濃度（0.1、5.0、100.0 μg·mL-1）日內(nèi)精密度的RSD值在2.06% ～5.72%，日間精密度的RSD值在2.44% ～ 6.12%，方法回收率在90.76% ～ 97.36%，萃取回收率在92.11% ～ 98.13%。血漿樣品在– 20 ℃下放置穩(wěn)定性和凍融穩(wěn)定性良好。結(jié)論：本方法快速、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好，符合生物樣品的測定要求，適合作為體內(nèi)紫杉醇含量的檢測方法。

紫杉醇；高效液相色譜法；血漿；炔諾酮

紫杉醇（paclitaxel，PTX）是從太平洋紅豆杉科紅豆杉屬Taxus brevifolia的樹皮中提取得到的一種抗癌藥物，主要是誘導(dǎo)和促進(jìn)微管蛋白聚合、裝配，穩(wěn)定微管，從而抑制腫瘤細(xì)胞生長[1]。20世紀(jì)20年代末期，美國FDA批準(zhǔn)紫杉醇為抗晚期癌癥的新藥，商品名為泰素（Taxol），現(xiàn)該藥已廣泛應(yīng)用于治療晚期及轉(zhuǎn)移性卵巢癌、乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌、前列腺癌、肺癌和頭頸部腫瘤等[2]。目前，紫杉醇的測定方法主要有分光光度法、熒光法以及液相色譜法等[3]，本研究建立的紫杉醇血漿樣品提取方法簡便、快速、穩(wěn)定，以炔諾酮為內(nèi)標(biāo)，使其高效液相色譜（HPLC）分析方法具有良好的重現(xiàn)性和靈敏性，適用于血漿中紫杉醇濃度的檢測。

1 材料

1.1 儀器

高效液相色譜儀LC-10A（日本島津公司）；Phenomenex C18反相色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；WH-861型渦旋振蕩器（江蘇太倉市科教器材廠）；1-15K冷凍臺式離心機(jī)（美國Sigma-Aldrich公司）；HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州國華電器有限公司）。

1.2 試劑

紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)品（陜西森弗生物技術(shù)有限公司，純度99%，批號20130721）；紫杉醇注射液（紫素，北京協(xié)和藥廠，批號141202)；炔諾酮（美國Sigma-Aldrich公司，純度＞ 98%，批號58H1258)；甲醇、乙腈、四氫呋喃、叔丁基甲基醚均為色譜純（加拿大Promptar公司），其它試劑均為商品化材料。空白血漿由首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院檢驗(yàn)科提供。

2 方法

2.1 色譜條件

色譜柱：Phenomenex C18反相色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為甲醇 : 乙腈 : 水= 40∶30∶30；流速：1.0 mL·min-1；檢測波長：227 nm；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。

2.2 儲備液的配制

準(zhǔn)確稱取紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)品適量于容量瓶中，用70%乙腈溶解制備成濃度為1.0 mg·mL-1的儲備液，需要時(shí)用70%乙腈稀釋成一定濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液。另準(zhǔn)確稱取內(nèi)標(biāo)物炔諾酮適量于容量瓶中，用流動(dòng)相溶解制備成濃度為2.5 μg·mL-1的儲備液。

2.3 血漿樣品預(yù)處理

吸取100 μL待測血漿樣本于10 mL離心管中，依次加入炔諾酮儲備液（內(nèi)標(biāo)，IS）和70%乙腈各100 μL，旋渦混勻。然后加入2.5 mL叔丁基甲基醚，旋渦混合5 min，于4000 r·min-1離心10 min。吸取上清液2 mL于玻璃試管中，在50 ℃水浴中通氮?dú)獯蹈?。然后加?00 μL 流動(dòng)相，旋渦混合5 min，使樣品充分復(fù)溶。

2.4 方法特異性

吸取空白血漿100 μL，加入紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)溶液（5.0 μg·mL-1）和炔諾酮儲備液各100 μL。另取上述空白血漿100 μL，加入200 μL 70%乙腈溶液，作為空白對照組。分別按照“2.3”項(xiàng)下方法處理樣品，吸取處理后的樣品20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，考察系統(tǒng)適用性。

2.5 線性范圍考察

以70%乙腈為溶劑，配制濃度分別為0.1、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、50.0、100.0 μg·mL-1的紫杉醇系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。吸取空白血漿100 μL，分別加入上述系列標(biāo)準(zhǔn)溶液和炔諾酮儲備液各100 μL，按照“2.3”項(xiàng)下方法處理樣品，吸取處理后的樣品20 μL注入色譜儀，記錄峰面積，以紫杉醇和炔諾酮的峰面積之比（APTX/AIS）-血藥濃度（C）進(jìn)行線性回歸。

2.6 精密度考察

分別取0.1、5.0、100.0 μg·mL-1的紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)溶液各100 μL和炔諾酮儲備液100 μL，加入到100 μL空白血漿中，作為相應(yīng)的低、中、高濃度組，按照“2.3”項(xiàng)下方法處理樣品并進(jìn)樣分析，計(jì)算紫杉醇和炔諾酮的峰面積之比（APTX/AIS）。每一濃度平行做5個(gè)樣品，連續(xù)測定5 d，考察本方法的日內(nèi)及日間精密度。

2.7 回收率考察

2.7.1方法回收率考察 分別取0.1、5.0、100.0 μg·mL-1的紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)溶液各100 μL和炔諾酮儲備液100 μL，加入到100 μL空白血漿中，作為相應(yīng)的低、中、高濃度組，按照“2.3”項(xiàng)下方法處理樣品并進(jìn)樣分析，計(jì)算紫杉醇和炔諾酮的峰面積之比（APTX/AIS）。每一濃度平行做5個(gè)樣品，分別代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算本方法的回收率。

2.7.2萃取回收率考察 分別取0.1、5.0、100.0 μg·mL-1的紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)溶液各100 μL和炔諾酮儲備液100 μL，加入到100 μL空白血漿中，作為相應(yīng)的低、中、高濃度組，按照“2.3”項(xiàng)下方法處理樣品并進(jìn)樣分析，記錄峰面積。另取0.1、5.0、100.0 μg·mL-1的紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)溶液各20 μL直接注入液相色譜儀，記錄峰面積。每一濃度平行做5個(gè)樣品，計(jì)算萃取回收率。

2.8 穩(wěn)定性考察

分別取0.1、5.0、100.0 μg·mL-1的紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)溶液各100 μL和炔諾酮儲備液100 μL，加入到100 μL空白血漿中，作為相應(yīng)的低、中、高濃度組，按照“2.3”項(xiàng)下方法處理樣品，每一濃度平行做5個(gè)樣品，將處理好的樣品在– 20 ℃冰箱中放置。分別于第0、1、7、15、30天各吸取20 μL注入色譜儀，記錄峰面積，考察樣品放置穩(wěn)定性。另取低、中、高濃度組的血漿樣品于– 20 ℃反復(fù)凍融3次，按照“2.3”項(xiàng)下方法處理樣品并進(jìn)樣分析，記錄峰面積，考察樣品凍融穩(wěn)定性。

2.9 臨床研究

經(jīng)首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，將本方法用于4例乳腺癌患者紫杉醇血藥濃度的測定。4例患者的平均年齡（42.3±6.5）歲，肝、腎功能正常，3周內(nèi)未接受化療和放療。紫杉醇給藥劑量為175 mg·m-2（溶于5%葡萄糖注射液，恒速靜脈滴注3 h），于滴注開始后0.5 h、1 h、2 h、滴注結(jié)束時(shí)以及滴注結(jié)束后1 h、2 h、3 h、4 h經(jīng)上肢靜脈取血1.0 mL，置于肝素化離心管中，4000 r·min-1離心10 min以分離血漿，血漿樣品按照“2.3”項(xiàng)下方法處理并進(jìn)樣分析，測定血漿藥物濃度。

3 結(jié)果

3.1 方法特異性

如圖1所示，在本實(shí)驗(yàn)條件下，主峰與雜質(zhì)峰完全分離，紫杉醇和內(nèi)標(biāo)物炔諾酮分離良好，不受血漿色譜峰的干擾，紫杉醇和炔諾酮的保留時(shí)間分別為11.4 min和7.8 min。紫杉醇理論塔板數(shù)為3352，拖尾因子為0.963，分離度為6.772，均符合規(guī)定，提示本方法測定紫杉醇的含量具有良好的特異性。

圖1 高效液相色譜圖A – 空白血漿，B – 空白血漿+內(nèi)標(biāo)，C – 空白血漿+紫杉醇，D –空白血漿+紫杉醇+內(nèi)標(biāo)；1 – 內(nèi)標(biāo)，2 – 紫杉醇Fig 1 HPLC chromatogramsA – blank plasma, B – IS in blank plasma, C – PTX in blank plasma, D – PTX plus IS in blank plasma; 1 – IS, 2 – PTX

3.2 線性范圍

以紫杉醇與炔諾酮峰面積的比值（APTX/AIS）作為縱坐標(biāo)（A），對紫杉醇濃度C（μg·mL-1）進(jìn)行線性回歸，得到回歸方程：A = 0.297 C + 0.539，r = 0.999 9，紫杉醇的線性范圍為0.1 ～ 100.0 μg·mL-1，線性關(guān)系良好。

3.3 精密度

日內(nèi)和日間精密度測定結(jié)果詳見表1。低、中、高3個(gè)濃度的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均在規(guī)定范圍內(nèi)（＜ 10%），表明該方法精密度良好。

表1 實(shí)驗(yàn)方法的精密度考察結(jié)果. n = 5Tab 1 The precision result of the method. n = 5

3.4 回收率

方法回收率和萃取回收率的測定結(jié)果見表2，血漿中低、中、高濃度樣品的方法回收率和萃取回收率均在90%以上，符合規(guī)定，表明該方法準(zhǔn)確度良好。

表2 實(shí)驗(yàn)方法的回收率考察結(jié)果. n = 5Tab 2 The recovery result of the method. n = 5

3.5 樣品的穩(wěn)定性

含紫杉醇血漿樣品在– 20 ℃條件下放置穩(wěn)定性和凍融穩(wěn)定性結(jié)果分別見表3和表4。結(jié)果表明，紫杉醇血漿樣品預(yù)處理后在– 20 ℃冰箱中保存30 d是穩(wěn)定的，反復(fù)凍融3次對紫杉醇濃度測定結(jié)果無影響。

3.6 臨床應(yīng)用

紫杉醇的藥-時(shí)曲線如圖2所示。由圖可見，實(shí)測血藥濃度范圍為0.11 ～ 3.14 μg·mL-1，均在本方法的線性范圍內(nèi)。在相同的給藥方案條件下，4例患者體內(nèi)的藥物濃度無明顯的個(gè)體差異，最高與最低峰濃度僅相差約1.5 倍。

4 討論

4.1 紫杉醇體內(nèi)濃度測定方法

藥物在體內(nèi)的分析方法有多種，如HPLC、HPLC-MS/MS、HPCE等[4-6]。關(guān)于紫杉醇在體內(nèi)的分析方法，早在其臨床前研究階段，Hamel等[7]就已開發(fā)了一種生化方法來檢測血中紫杉醇的含量。由于該方法步驟冗長、操作繁瑣，當(dāng)紫杉醇進(jìn)入Ⅰ期臨床試驗(yàn)后，HPLC法很快成為主要的分析手段?，F(xiàn)已報(bào)道的HPLC法多采用液相萃取法或固相萃取法對生物樣品進(jìn)行前處理[8-10]，這些方法都能有效地分離血漿中的紫杉醇。盡管與液相萃取法相比，固相萃取法具有操作簡便、分離效果好等優(yōu)勢，但過高的成本限制了其在臨床的廣泛應(yīng)用。本實(shí)驗(yàn)在參考文獻(xiàn)基礎(chǔ)上，選擇液相萃取法作為樣品前處理的方法，對提取條件等進(jìn)行了優(yōu)化。處理后的樣品在所建立的色譜條件下，主峰與各雜質(zhì)峰具有良好的分離度，方法穩(wěn)定，精密度和回收率均符合規(guī)定，能夠達(dá)到生物樣品的分析要求。

表3 血漿樣品– 20 ℃下放置穩(wěn)定性考察結(jié)果. n = 5Tab 3 The stability of PTX in blank plasma at – 20 ℃. n = 5

表4 血漿樣品凍融穩(wěn)定性考察結(jié)果. n = 5Tab 4 The stability of test samples after freeze-thaw for three times. n = 5

圖2 紫杉醇的血藥濃度-時(shí)間曲線Fig 2 Blood concentration-time curve of paclitaxel

4.2 提取溶劑的選擇

本實(shí)驗(yàn)在提取溶劑的選擇上分別考察了無水乙醚、乙酸乙酯和叔丁基甲基醚的萃取效率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)采用無水乙醚、乙酸乙酯作萃取劑時(shí)，提取得到的血漿中的內(nèi)源性雜質(zhì)比較多，干擾測定結(jié)果。而采用叔丁基甲基醚作萃取劑，可以消除內(nèi)源性雜質(zhì)的干擾，同時(shí)取得了滿意的提取率（萃取回收率在90%以上）。由于叔丁基甲基醚的極性較低，作為萃取劑能夠使EP管中的增塑劑等雜質(zhì)溶出，對測定造成干擾，因此使用玻璃離心管作為萃取容器。

4.3 內(nèi)標(biāo)物的選擇

人血中紫杉醇的分析方法，國內(nèi)文獻(xiàn)報(bào)道多以地西泮為內(nèi)標(biāo)，采用液相萃取法[11]。而國外相關(guān)文獻(xiàn)中，多以巴卡亭為內(nèi)標(biāo)，但多采用固相萃取法，其過程繁瑣，穩(wěn)定性和重復(fù)性較差[12]。而炔諾酮是一種孕激素甾體藥物，在《中國藥典》中其HPLC法測定含量的檢測波長為244 nm，在水相和有機(jī)相中的分配情況、揮發(fā)性、對萃取容器的吸附性以及層析行為等均與紫杉醇相似，因此被選作內(nèi)標(biāo)物[13-14]。炔諾酮的濃度選擇為2.5 μg·mL-1是根據(jù)其與標(biāo)準(zhǔn)曲線中段的紫杉醇（2 μg·mL-1）響應(yīng)值比近似為1 而確定的。

4.4 流動(dòng)相的選擇

采用甲醇和水作為流動(dòng)相時(shí)，高效液相色譜儀器的系統(tǒng)壓力過大；而采用磷酸鹽緩沖溶液作為流動(dòng)相時(shí)，由于流動(dòng)相中含有磷酸鹽成分，容易導(dǎo)致管道堵塞，進(jìn)而造成系統(tǒng)壓力過大[15]。本檢測過程中采用了甲醇 : 乙腈 : 水 = 40∶30∶30作為流動(dòng)相，峰形對稱，無拖尾現(xiàn)象。

綜上，本方法快速、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好，符合生物樣品的測定要求，并實(shí)際應(yīng)用于4例患者體內(nèi)藥物濃度的測定，適合作為體內(nèi)紫杉醇含量的檢測方法。

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Determination of paclitaxel in human plasma by HPLC

ZHANG Yang, YU Jun-xian
(Department of Pharmacy, Beijing Friendship Hospital, Capital Medical University, Beijing 100050, China)

Objective:To establish a method for analyzing the concentration of paclitaxel (PTX) in human plasma.Methods:PTX was measured by high performance liquid chromatography (HPLC) with Phenomenex C18column (250 mm × 4.6 mm, 5 μm) at 40 ℃. Norethisterone was used as the internal standard. The mobile phase was consisted of methanol, acetonitrile and water (40 : 30 : 30), the flow rate was 1.0 mL·min-1and the detection wavelength was 227 nm.Results:The peak of impurities and component could be well separated, the retention time of paclitaxel and norethisterone were 11.4 min and 7.8 min, respectively. Excellent linear calibration curve of paclitaxel was obtained within the concentration range of 0.1 – 100.0 μg·mL-1(r = 0.999 9). The intra- and interday precision for low, middle and high concentration (0.1, 5.0, 100.0 μg·mL-1) showed that RSD were 2.06% – 5.72% and 2.44% –6.12%, respectively. The recovery of the method was in the range of 90.76% – 97.36%, and the extraction recovery of the method was in the range of 92.11% – 98.13%. Paclitaxel in human plasma was stable after storage at – 20 ℃ or freeze-thaw for three times.Conclusion:This method is rapid, accurate and reproducible, which is consistent with the requirement for determining biological specimen and suitable for detection of paclitaxel concentration in human plasma.

Paclitaxel; HPLC; Plasma; Norethisterone

R917

A

1672 – 8157(2015)06 – 0343 – 05

2015-07-14

2015-10-09）

2015年度首都中醫(yī)藥研究專項(xiàng)（15ZY14）

張楊，男，碩士，藥師，主要從事臨床藥學(xué)工作。E-mail：david19872005@163.com